РАСТИТЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ IN VITRO ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ТОРФА О. А. Рожанская

Представлены тест-системы на базе культуры растительных тканей in vitro для определения общей биологической активности, а также дифференцированного тестирования ауксиновой и цитокининовой активности препаратов из торфа.

Торф является практически неограниченным источником дешёвого сырья для производства высокоэффективных удобрений и стимуляторов роста растений [1-3]. Для тестирования биологической активности новых торфяных препаратов применяются растительные системы in vitro. Эти тест-системы по сравнению с рулонной культурой и полевым опытом обладают более высокой чувствительностью и возможностью контроля факторов внешней среды.

Известно, что культура изолированных растительных тканей in vitro практически невозможна без применения экзогенных регуляторов роста - фитогормонов. Чаще всего используются вещества, принадлежащие к двум типам фитогормонов: ауксины, способствующие увеличению размеров клеток, и цитокинины, вызывающие их деление. Типичная схема гормонального контроля органогенеза описана Скугом и Миллером [4] на примере каллуса табака: образование побегов стимулируется при условии преобладания концентрации цитокинина по отношению к ауксину, тогда как обратное соотношение способствует образованию корней. Эта модель приемлема для большинства видов растений; при этом концентрации гормонов широко варьируют и для каждого вида или сорта определяются эмпирически.

Нами разработаны методы определения биологической активности новых стимуляторов роста растений с помощью культуры стеблевых узлов рапса, люцерны, эспарцета, сои, нута in vitro.

Методика. Тест-система «культура почек in vitro». Экспланты стеблевых узлов или почек асептических растений пассируют для развития и укоренения на агаризованные питательные среды с минеральной основой Гамборга В5 [6] половинной концентрации (1/2В5). В контрольном варианте фитогормоны отсутствуют, в экспериментальные среды перед автоклавированием добавляют изучаемый препарат в разных дозах. В качестве тест-функций используются показатели морфогенеза: частота образования побегов и корней, высота побега, число листьев и корней, длина корней.

Тест-система «каллусообразование в культуре листовой ткани рапса in vitro» для определения ауксиновой активности. Экспланты листьев асептических растений рапса помещают на агаризованные питательные среды с минеральной основой Мурасиге-Скуга (MS) . В контрольном варианте присутствует ауксин 2,4-Д в дозе 1 мг/л, в экспериментальные

среды перед автоклавированием добавляют изучаемый препарат в разных дозах. Тестфункциями являются: частота образования каллуса, объём или масса каллусной ткани.

Тест-система «регенерация побегов в каллусной ткани рапса in vitro» для определения цитокининовой активности. Экспланты листового каллуса помещают для регенерации на агаризованные питательные среды с минеральной основой MS. В контрольном варианте присутствует цитокинин БАП в дозе 1 мг/л, в экспериментальные среды перед автоклавированием добавляют изучаемый препарат в разных дозах.

Продолжительность тестирования in vitro 2-4 недели независимо от времени года. Для обеспечения стабильных результатов необходим строгий контроль освещённости (2 тыс. лк при 16-часовом фотопериоде) и поддержание постоянной температуры. Опыты имеют 3 повторности во времени, объем выборки в каждом варианте составляет 20-30 эксплантов. Достоверность различий средних оценивается с помощью критериев статистики.

Новый биостимулятор ТТС произведен в лаборатории агроэкологии ТГПУ из низинного торфа. Он представляет собой водный раствор высокомолекулярных веществ с концентрацией ГК 0,0875%. Структурные особенности препарата представлены в виде спектральных коэффициентов (ОН/С=С - 0.87; С=О/С=С - 0.97; Салк/С=С - 0.85; ОН/Салк- 1.02; С=О/Салк - 1.14). Количество парамагнитных центров 3,1E+16 спин/г.

Результаты. Тест-система «культура почек in vitro». Стеблевые узлы ярового рапса инкубировали 20 суток при температуре 21оС. Под действием препарата ТТС, введённого в питательную среду в дозе 0,5 мл/л, возрастала высота побегов рапса, увеличивалось число листьев на побеге, число и длина корней (рис. 1). Менее активное стимулирующее действие ТТС на рост и развитие побегов отмечено в дозе 1 мл/л. Увеличение дозы до 10 мл/л привело к значительному снижению высоты побегов, частоты ризогенеза, количества и длины корней.

Влияние ТТС на развитие побегов рапса

Рис. 1. Результат определения биологической активности торфяного препарата ТТС

с помощью тест-системы «культура почек рапса in vitro» (контроль 100 % - на среде 1/2В5 без добавок)

Стеблевые узлы нута инкубировали 4 недели при температуре 28оС (табл. 1). Препарат ТТС, введённый в питательную среду в дозе 1 мл/л, способствовал увеличению высоты побегов нута, числа листьев на побеге, частоты ризогенеза, количества корней. В дозе 0,5 мл/л эффект ТТС был слабым, а доза 10 мл/л ингибировала рост побегов и корней.

Примечание: разница средних арифметических с контролем достоверна на 5 % уровне.

Тест-система «листовая ткань рапса in vitro». Экспланты листьев рапса на контрольной среде за 25 суток культивирования почти все сформировали каллусную ткань (табл. 2), при этом её развитие в среднем составило 2,7 балла по 4-балльной шкале, и каждый третий эксплант был полностью покрыт каллусом (4 балла).

Добавки ТТС в дозах от 0,5 до 5 мл/л в присутствии 2,4-Д снизили активность каллусообразования: почти половина эксплантов имели едва заметную каллусную ткань (1 балл), и ни один не был покрыт каллусом полностью. Очевидно, препарат ТТС ингибировал пролиферацию каллусных клеток. Вариант опыта с исключением ауксина 2,4-Д показал, что ТТС в дозе 1 мл/л за 25 дней инкубации вызвал увеличение площади листовых эксплантов в 3-4 раза, но не проявил способности к индукции каллусогенеза.

Примечание: разница средних арифметических с контролем достоверна на 5 % уровне.

Тест-система «регенерация побегов в каллусной ткани рапса in vitro». Полученную в предыдущих опытах листовую каллусную ткань пассировали на питательные среды MS для регенерации: стандартную с цитокинином БАП 1 мг/л (контроль), с добавками ТТС и исключением цитокинина для проверки цитокининовой активности препарата. За 30 суток инкубации объём каллуса увеличился в 10-20 раз (табл. 3), началось образование побегов (стеблевой морфогенез) и корней (ризогенез). Добавки препарата ТТС в дозе 0,5 мл/л привели к снижению пролиферации каллуса.

Примечание: разница средних арифметических с контролем достоверна на 5 % уровне.

На средах без цитокинина в варианте с ТТС 0,5 мл/л отсутствовала регенерация побегов, но многократно увеличилась частота ризогенеза. В дозе 5 мл/л ТТС проявил способность к индукции стеблевого морфогенеза рапса с небольшой частотой, в этом варианте каллус был более опушенным, а частота образования корней достигла 100%. Добавка ТТС в дозе 10 мл/л в отсутствие БАП индуцировала регенерацию побегов с более высокой частотой, чем на контроле. Таким образом, результатами опыта доказана цитокининовая активность препарата ТТС. Кроме того, препарат ТТС показал себя более активным стимулятором корневого морфогенеза, чем БАП.

Обсуждение. Анализ экспериментальных данных говорит о высокой биологической активности препарата ТТС, способствующего ускорению и повышению эффективности микроклонального размножения растений. Эффективная доза для стимуляции роста дифференцированных органов рапса - 0,5 мг/л, нута - 1 мг/л.

Тестирование препарата в регенерационной системе рапса продемонстрировало отсутствие специфической ауксиновой активности, индуцирующей дедифференцировку клеток. К тому же препарат ингибировал рост каллусной ткани на средах для каллусообразования и регенерации.

С другой стороны, ТТС индуцировал регенерацию побегов рапса из каллусной ткани в отсутствие цитокинина, что доказывает его высокую биологическую активность ци- токининового типа. Доза ТТС 10 мл/л с успехом может заменить цитокинин БАП, применяемый в концентрации 1 мг/л для регенерации рапса. Кроме того, ТТС оказался хорошим стимулятором ризогенеза. В дозе 0,5 мл/л на фоне БАП 1 мг/л препарат способствовал увеличению частоты ризогенеза в 2,5 раза при значительном росте числа и длины корней. Выводы Тестирование препарата ТТС с помощью тест-систем «культура почек рапса и нута in vitro» выявило биологическую активность, способствующую достоверному ускорению ризогенеза, роста побегов и корней. Эффективные дозы не превышали 1 мл/л. Исследование ауксиновой активности препарата ТТС в тест-системе «каллусообразование в культуре листовых тканей рапса in vitro» показало полное отсутствие способности к индукции дедифференцировки. Исследование препарата ТТС в тест-системе «регенерация побегов в каллусной ткани рапса in vitro» продемонстрировало его высокую биологическую активность цитоки- нинового типа. Препарат в дозе 5-10 мл/л индуцировал регенерацию побегов даже в отсутствие цитокинина, и при этом активнее, чем БАП, стимулировал корневой морфогенез рапса.

Литература Инишева Л. И. Рациональное использование торфяных ресурсов России как фактор устойчивого развития // Мат-лы междунар. науч.-практ. конф. (12-15 марта 2003 г.). - Томск, 2003. - С. 27-41. Горовая А. И., Орлов Д. С. Гуминовые вещества. - Киев: Наукова думка, 1995. - 303 с. Юдина Н. В., Писарев С. И., Саратиков А. С. Оценка биологической активности гуминовых кислот торфов // Химия твёрдого топлива. - 1996. - №5. - С. 31-34. Skoog F., Miller C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro / Simp. Soc. Exptl. Biol. - 1957. - No 11. Рожанская О. А., Юдина Н. В., Ломовский О. И., Королев К. Г. Влияние регуляторов роста растительного происхождения на морфогенез рапса in vitro // Сиб. вестник с.-х. науки. - - 2003. - № 2. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. plant. - 1962. - Vol.15. - P. 473-497. Gamborg O. L., Miller R. A., Ojima K. Nutrient requirement of suspension cultures of soybean root cell // Exp.Cell Res. - 1968. - Vol. 50. - P. 151-158.

VEGETABLE SYSTEMS IN VITRO

FOR TESTING THE BIOLOGICAL ACTIVITY PREPARATION FROM РЕАТ

O. A. Rozhanskaya

The Presented test-systems on the base of the culture vegetable fabric in vitro for determination of the general biological activity, as well as differentiated testing auksin and citokinin to activities preparation peat.