Анаэробное образование сукцината и облегчение его окисления возможные механизмы адаптации клетки к кислородному голоданию

Показаны важная роль анаэробного образования сукцината при аноксичееких и гипоксических состояниях, а также активация окисления сукцината в условиях гипоксии. Сделан вывод, что для поддержания знергсжки животных клеток в условиях кислородного голодания при аноксии и гипоксии целесообразно использовать субстраты, способные участвовать в анаэробном образовании сукцината, тогда как в гипоксическнх условиях имеет смысл использовать собственно сукцинат. Ключевые слова: анаэробные процессы, гипоксия, митохондрии, субстраты.

Кислородное голодание встречается при многих физиологических состояниях и заболеваниях сердечно- сосудистой системы, легких, крови, отравлениях различными лекарственными препаратами и ядами. В зависимости от глубины кислородного голодания различают гипоксию и аноксию. На уровне митохондрии (MX) состояния гипоксии и аноксии отличаются по степени восстановленности дыхательных переносчиков. При аноксии, характеризующейся отсутствием доставки кислорода к клеткам, все переносчики дыхательной цепи полностью восстановлены. При гипоксии, когда частично сохранена доставка кислорода, наиболее удаленные от кислорода пиридин-нуклеотиды - НАД и НАДФ, как правило, восстановлены на 100%, тогда как часть флавопротеидов и цитохромныи участок дыхательной цепи остаются в значительной мере окисленными [1,2]. Такие различия в степени восстановленности пиридиннуклеотидов и флавопротеидов позволили предположить [З], что в условиях гипоксии имеется возможность для преимущественного окисления янтарной кислоты, поскольку, сукцинатдегидрогеназа в отличие от большинства других дегидрогеназ является флавинзависимым ферментом. При этом всегда возникал вопрос, откуда берется сукцинат, если НАД- зависимые субстраты окисляться не могут. С другой стороны, известно, что в аноксических условиях сукцинаг не окисляется, а накапливается в результате образования из НАД-зависимых субстратов и аминокислог [4 -7]. Мы предположили, что анаэробное образование сукцината (АОС) можег идти не только при аноксии, но и при гипоксии. Цель настоящей работы заключалась в анализе функционального значения образования и окисления янтарной кислоты при кислородном голодании. Рассмотрим сначала аноксические условия. Аноксию моделировали in vitro путем инкубации густой суспензии MX (15 20 мг белка на мл) в закрытой ячейке, когда за несколько секунд МX полностью восстанавливают растворенный в инкубационной среде кислород, либо путем внесения в инкубационную среду антиминина А, блокирующею дыхательную цепь на уровне циюхрома b, что предотвращает окисление в дыхагельнои цепи как пиридиннуклеотидов, так и флавопротеидов. Образование сукцината из различных субстратов измеряли методом Н-ЯМР-спектроскопии [7]. Оказалось, что АОС в изолированных митохондриях печени, сердца и коркового слоя почек крысы интенсивно идет из а-кетоглутаpaтa с малатом, а-кетоглутарата с аммонием и из малата (рис. 1).

В митохондриях печени морской свинки кроме указанных источников сушественный вклад в процесс АОС вносит фосфоенолпируват в присутствии бикарбоната. В литературе доминирует представление о том, что адаптивная роль АОС обусловлена поддержанием образования богатых энергией соединений. Однако выполненые нами исследования [8,9] показали, что энергетический выход процесса АОС мал и в лучшем случае способен лишь затормозить падение oтношения АТФ/АДФ и величины трансмембранного электрохимического потенциала ионов водорода в изолированных MX. Но на уровне клеток активация АОС в присутствии глюкозы оказалась энергетически весьма эффективной: существенно препятствовала падению отношения АТФ/АДФ в изолированных кардиомионитах и культивируемых клетках почки [Ч]. Сопоставив полученные данные с литературными данными, мы предположили, что АОС траст особую адаптивную роль в клетках животных. Не исключая из рассмотрения собственный вклад ДОС в энергетику клеток, можно полагать, чю зтот процесс выполняет также роль дополнительного акцептора воссгановительных эквивалентов, обеспечиваюшего их отток из цитозоля, из реакций гликолитичсской оксидоредукции, например, так, как это показано на рис.2. В результате может поддерживаться высокая активность гликолиза при относительно небольшом приросте лактата. Соответственно конечными продуктами анаэробного обмена при этом являются не только лактат и пируват, но еще аланин и сукцинат. Не исключено, что повышение устойчивости клеток и MX к аноксии при активации АОС обусловлено тем, что процесс АОС обеспечивает протекание ряда ферментативных реакций в цикле трикарбоновых кислот и в дыхательной цепи, несмотря на отсутствие кислорода. Поддержание редокс-превращений субтратов и дыхательных переносчиков является важным фактором морфофункциональной стабилизации MX (10). Анализ гипоксической ситуации мы провели на двух моделях: 1) при инкубации MX в среде с пониженным в шесть раз парциальным давлением кислорода и 2) при торможении дыхательной цепи MX ротеноном, блокирующим перенос восстановительных эквивалентов от пиридиннуклеотидов до флавопротеидов, вследствие чего создастся ситуация, подобная гипоксии: восстановленные пиридиннуклеотиды и соответственно НАД-зависимые субстраты окисляться не могут, а флавопротеиды сохраняются в окисленном состоянии. Оказалось, что в условиях ротенонового блока может происходить дисмутация а-кетоглутарата в присутствии аммония (реакция 5 на схеме рис.2), что проявляется в виде poтеноннечувствительного дыхания, ингибируемого малонатом (11). Другие субстратные композиции, также и даже в большей мере, чем дисмутация а-кетоглутарата, способны поддерживать на фоне ротенонового блока генерацию трансмембранного потенциала, подобно экзогенному сукцинату (рис.3). Отсюда мы сделали вывод, что реакции АОС могут происходить не только в условиях аноксии при полном восстановлении дыхательной цепи,но и в том случае, когда имеется достаточно высокий уровень восстановленности пиридиннуклеотидов при гипоксии.

Рис.2. Схема возможного взаимодействия гликолитической оксидоредукции (1) некоторых реакций АОС . Показано уменьшение образования лактата при вовлечении части пирувата в переаминирование (2) при использования восстановительных эквивалентов, поставляемых малат-аспартатным челноком (3). в реакциях восстановительного обращения цикла трикарбоновых кислот до сукцината (4) и в анаэробной дисмутации а-кетоглутарата (5).

Для решения вопроса о возможности ускорения окисления сукцината относительно НАД-зависимых субстратов в гипоксических условиях мы использовали подход, позволяющий по скоростям потребления кислорода и образования углекислого газа отличать окисление сукцината от пирувата, а-кетоглутарата или изоцитрата. Как показано на рис.4, скорости дыхания и окислительного фосфорилирования при окислении сукцината намного выше, чем при окислении пирувата. Окисление пирувата сопряжено со значительным выделением в среду углекислоты, соответственно величина дыхательного коэффициента ДК достигает 2,0. Тогда как при окислении сукцината величина ДК нс превышает 0,01. Таким образом, по характерным кинетическим кривым регистрации потребления кислорода и образования СО2 можно уверенно отличать окисление пирувата (а также а-кегоглутарата или изоцитрата) от окисления сукцината. В случае совместного внесения в инкубационную среду обоих субстратов, при последовательном увеличении отношения сукцицат/пируват происходило быстрое падение ДК и АДФ/0 с одновременным увеличением скоростей дыхания и степени восстановления трансмембранного потенциала после фосфорилирования АДФ, что характерно для сукцината (таблица1). Возможно, это отражает предпочтительное окисление сукцината, хотя величина Км для сукцината в нормоксических условиях выше, чем для пирувата (таблица2).

Рис.3. Изменение мембранного потенциала, измеренного по распределению липофильного катиона тетрафенилфосфония (ТФФ) между средой и матриксом MX печени, под влиянием ротенона и экзогенных субстратов (сукцината и субстратов - источников АОС). Условия инкубации, как на рис.1. Концентрация MX 4 мг белка на мл. Видно, что ЦАД-эаииснмые субстраты, способные участвовать в АОС, в отличие от б-оксимасляной кислоты, в разной степени поддерживают мембранный потецциал, подобно добавке сукцината.

При снижении Ро2 в инкубационной среде от 150 до 25 мм рт.ст. - условия, в которых может возрастать степень восстановленности пиридиннуклеотидов [ 5 ], - константа сродства для сукцината существенно снижалась, а для пирувата возрастала (табл.2). Возможно, это отражает изменение как активности транспортных систем MX, так и соответствующих дегидрогеназ, в частности активацию сукцинатдегидрогеназы при увеличении степени восстановленности дыхательных переносчиков и, напротив, торможение окисления НАД-зависимых субстратов при росте отношения НАДН/НАД. Такое увеличение сродсгва к сукцинату при снижении PQ хорошо согласуется с ранее полученными нами данными о значительном (на 45 %) снижении содержания сукцината в ткани печени крыс, находившихся в течение 15-30 мин. в условиях гипоксии (в барокамере на высоте 8000 м). Таблица 1. Изменение скоростей дыхания митохондрий печени, дыхательного коэффициента, отношения АДФ/0 и степени восстановления трансмембранного потенциала после фосфорилирования добавленного АДФ в зависимости от соотношения экзогенных сукцината и пирувата в инкубационной среде.

Таблица 2. Сравнение кажущихся констант сродства для сукцината и пирувата, рассчитанных в oбратных координатах 1/S и 1/V Лайнуивера-Бэрка по скоростям потребления кислорода изолированными митохондриями печени крысы.

Представленные данные свидетельствуют о важной роли анаэробного образования сукцицата при аноксических и гипоксических состояниях, а также об активации окисления сукцината в условиях гипоксии. Отсюда следует, что в качестве средств поддержания энергетики животных клеток в условиях кислородного голодания при ацоксии и гипоксии целесообразно использовать субстраты, способные участвовать в анаэробном образовании сукцината, тогда как в гипоксических условиях имеет смысл использовать собственно сукцинат.