Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему: Роль рецепторов эстрогенов, прогестерона, андрогенов, онкобелка HER-2, антигена Ki-67 в прогнозе рака молочной железы

Автореферат диссертации по медицине на тему Роль рецепторов эстрогенов, прогестерона, андрогенов, онкобелка HER-2, антигена Ki-67 в прогнозе рака молочной железы

На правах рукописи

АНИКЕЕВА Наталья Валерьевна

РОЛЬ РЕЦЕПТОРОВ ЭСТРОГЕНОВ, ПРОГЕСТЕРОНА, АНДРОГЕНОВ, ОНКОБЕЛКА НЕК-2, АНТИГЕНА Кл-67 В ПРОГНОЗЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.00,46 - клиническая лабораторная диагностика 14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в лаборатории морфологических исследований отдела морфологии и клеточной патологии сектора клинического лабораторно-диагностического Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России

доктор биологических наук Кравцов Вячеслав Юрьевич кандидат медицинских наук Эллиниди Вера Николаевна

доктор биологических наук профессор Слозина Наталья Михайловна член-корреспондент РАЕН.

доктор медицинских наук профессор Пожарисский Казимир Марианович

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова

Защита состоится «25» мая 2006 в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России.

Ученый секретарь \ кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Рак молочной железы (РМЖ) — серьезная медицинская и социальная проблема для большинства развитых стран мира: Несмотря на значительные достижения последней четверти XX века в понимании биологии и клиники заболевания, а также кардинальные изменения в подходе к лечению, проблема продолжает оставаться высокоактуальной.

К настоящему моменту сообщается более чем о ста факторах прогноза, дающих представление о биологическом поведении опухоли, а для предсказания клинического течения опухолевого процесса и исхода при РМЖ большое значение придается маркерам, выявляемым иммуногистохимическим методом [Пожарисский К.М., Леепман Б.Е., 2000].

Одними из первых вошедших в практику клеточных маркеров были рецепторы эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), роль которых в генезе гормонозависимых опухолей доказана большим количеством исследований [Сергеев П.В., 1994; Семиглазов В.Ф. и соавт., 1992]. Определение РЭ и РП в ткани опухоли сейчас рассматривается как обязательное условие для успешного гормонального лечения РМЖ [АИгес! В.С. е1 а1., 1998; Бернштейн Л.М., 2000; Семиглазов В.Ф., 2001]. При метастатических поражениях степень реакции на гормональную терапию также существенно зависит от наличия РЭ и РП в опухоли: ее эффективность составляет около 10 % при РЭ-отрицательных опухолях, примерно 50 % при РЭ-положительных опухолях и около 75 % при опухолях, содержащих одновременно РЭ и РП. Тем не менее, известны случаи резистентности к гормонотерапии больных с РЭ- и РП-положительными РМЖ, поэтому гормонально-рецепторный статус опухоли оказывается не всегда достаточным показателем гормональной чувствительности РМЖ [Летягин В.П., 2004]. Вопрос о прогностическом значении выявления РП в РМЖ, несмотря на большое количество исследований, до сих пор остается открытым.

Исследования последних лет выявили, что злокачественные опухоли молочной железы в 50 % случаев содержат рецепторы андрогенов (РА) [5еНт А.й. е1 а1., 2002]. Однако их роль в течении опухолевого процесса пока неясна. Предполагается, что в дополнение к рецепторам эстрогенов и прогестерона, рецепторы андрогенов могут быть важны в контроле за ростом РМЖ [Вгуз М. « а1., 2002], а также в более тщательном отборе пациентов для проведения адекватной гормональной терапии [¿а^Ьагш N. е1 а1., 1997].

Не вызывает сомнения тот факт, что эстрадиол индуцирует синтез факторов роста [Бернштейн Л.М., 1998, 2000], рецепторы которых, например рецептор эпидермального

фактора роста, имеют сходство с некоторыми онкобелками [Носов Д.А., 2002]. В их число входит мембранный гликопротеид HER-2 [Wang D.,1993], являющийся членом семейства тирозинкиназных рецепторов и одним из самых перспективных маркеров для предсказания возникновения рецидивов заболевания, появления метастазов, резистентности к химио- и гормонотерапии РМЖ [Slamon D. et al, 2001; Пожарисский K.M., Леенман Е.Е.Г2002; Хансон К.П., 2002; Семиглазов В.Ф., 2001].

Ведущим фактором в механизме злокачественной трансформации клеток и в биологическом поведении уже возникших опухолей является их пролиферативная активность. Для выявления особенностей пролиферации клеток злокачественных опухолей человека широко используется антиген Ki-67, экспрессирующийся практически во всех фазах митотического цикла и отражающий величину пролиферативного пула [Пожарисский K.M., ЛеенМан Е.Е., 2000].

До сегодняшнего дня значимость отдельных вышеперечисленных маркеров, выявляемых иммуногистохимическим методом, остается недоказанной, кроме того, на сегодняшний день согласованного мнения о прогностической роли экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и, особенно, андрогенов, Ki-67, онкобелка HER-2 и сочетания этих факторов нет.

Цель исследования. Комплексное изучение содержания и уровня экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, андрогенов, экспрессии онкобелка HER-2 (с-егЪВ2) и антигена Ki-67 и определение диагностической значимости этих маркеров, выявляемых иммуногистохимическим методом, для прогноза клинического течения рака молочной железы.

Задачи исследования. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить содержание и уровень экспрессии рецепторов андрогенов с одновременным определением содержания и уровня экспрессии рецепторов эстрогенов й рецепторов прогестерона в клетках рака молочной железы.

2. Изучить клинико-морфологические особенности течения рака молочной железы с различными гормонально-рецепторными фенотипами опухоли.

3. Определить уровень экспрессии онкобелка HER-2 в клетках рака молочной железы с различными гормонально-рецепторными фенотипами.

4. Определить уровень экспрессии антигена Ki-67 в клетках рака молочной железы с различными гормонально-рецепторными фенотипами.

Основные положении, выносимые на защиту:

1. В клетках рака молочной рецепторы эстрогенов выявляются в 48 % случаев, рецепторы прогестерона - в 43 % случаев, рецепторы андрогенов — в 47 %

2. В клетках рака молочной железы рецепторы андрогенов выявляются в 69 % опухолей, содержащих рецепторы эстрогенов и прогестерона, и в 11% опухолей, не содержащих рецепторы эстрогенов и прогестерона.

3. Основными гормонально-рецепторными фенотипами рака молочной железы являются те, в которых отмечается одновременная экспрессия рецепторов эстрогенов, прогестерона и андрогенов или одновременное отсутствие рецепторов стероидных гормонов.

4. Опухоли, не содержащие рецепторы эстрогенов и прогестерона, а также содержащие только рецепторы прогестерона характеризуются более злокачественным клиническим течением.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение клинико-лабораторных характеристик клеток рака молочной железы: содержания и уровня экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, андрогенов, онкобелка НЕЯ-2, антигена Кл-67 с применением высокочувствительного и специфичного иммуногистохимического метода.

Впервые отмечено, что опухоли, не содержащие рецепторы эстрогенов и прогестерона, а также имеющие только рецепторы прогестерона, характеризуются более агрессивным клиническим течением.

Впервые одновременно с рецепторами эстрогенов и прогестерона определили содержание и уровень экспрессии рецепторов андрогенов в клетках рака молочной железы, что позволило выделить дополнительную группу пациентов с опухолями, не содержащими рецепторы эстрогенов и прогестерона и имеющими рецепторы андрогенов.

Комплексный подход к изучению рака молочной железы с определением совокупности клеточных маркеров, выявляемых иммуногистохимическим методом, и сравнение их с клинико-морфологическими критериями прогноза клинического течения опухоли позволили выделить важную роль содержания и уровня экспрессии рецепторов прогестерона. Снижение уровня экспрессии рецепторов прогестерона в клетках рака молочной железы является важным предсказательным фактором низкой эффективности противоопухолевой гормональной терапии и может рассматриваться как показатель неблагоприятного прогноза клинического течения рака молочной железы.

Практическая значимость работы. Предложена программа комплексного лабораторного иммуногистохимического исследования клеток рака молочной железы, включающая определение содержания и уровня экспрессии рецепторов стероидных гормонов: эстрогенов, прогестерона, андрогенов, онкобелка НЕЯ-2 и антигена Кь67 для

формирования прогноза клинического течения рака молочной железы и отбора групп пациентов для проведения адекватной гормональной и химиотерапии.

Выделены группы пациентов с опухолевыми фенотипами, обладающими неблагоприятными прогностическими и предсказательными характеристиками.

При отсутствии в клетках рака молочной железы рецепторов эстрогенов и рецепторов прогестерона рекомендуется дополнительное количественное определение рецепторов андрогенов чувствительным и высокоспецифичным иммуногистохимическим методом, что позволит в случае выявления в опухоли рецепторов андрогенов, выделить группу пациентов для дальнейшего клинического обследования и наблюдения с целью решения вопроса о выборе гормональной противоопухолевой терапии.

Апробация работы. Результаты исследования изложены в виде стендового доклада на Международной конференции в г. Иркутске (сентябрь 2003 г.); на IV Конгрессе по аутоиммунитету «КК-клетки (СБ5б, СИ 16) и экспрессия антигена Кь67 в раке молочной железы с различным гормонально-рецепторным статусом» (г. Будапешт, ноябрь 2004 г.); на Международном конгрессе по РМЖ (г. Брюссель, январь 2006 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трех глав собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и иллюстрирована 31 таблицей и 24 рисунками. Список литературы содержит 24 отечественных и 108 иностранных источников литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследуемой группы пациентов. При выполнении настоящего исследования в обследуемую группу были включены 344 пациента Ленинградского и Псковского областных онкологических диспансеров, которым в период с июля 2002 г. по декабрь 2004 г. был поставлен диагноз РМЖ.

Всем пациентам' . проводилось комплексное обследование в условиях вышеперечисленных лечебных учреждений: осмотр врача-онколога, выполнение рентгенографического и ультразвукового исследований молочных желез. Для выяснения характера новообразования молочной железы выполнялось цитологическое исследование (тонкоигольная аспирационная биопсия) и гистологическое исследование (трепан-биопсия или операционный материал).

Приготовление парафиновых блоков, срезов, окрашивание препаратов гематоксилином-эозином по стандартной методике и последующая верификация диагноза

проводились специалистами' патолого-анатомических лабораторий этих лечебных учреждений с последующим пересмотром гистологических препаратов и подтверждением диагноза РМЖ в лаборатории морфологических исследований ВЦЭРМа МЧС России.

Иммуногистохимическое определение содержания рецепторов эстрогенов, рецепторов прогестерона и апдрогенов, онкобелка HER-2, антигена Ki-67 в клетках рака молочной железы. В. работе применялся одноэтапный авидин-биотиновый иммуногистохимический метод визуализации антигенов (протокол фирмы «Novocastra»), В качестве первых антител использовались антитела фирмы «Novocastra» (Великобритания) и фирмы «DAKO» (Дания), в качестве системы визуализации - АВС-Kit (universal) фирмы «Novocastra». Для выявления цветового окрашивания результата реакции применялся DAB фирмы «Pharmingen».

Гистологические срезы помещались на предварительно обработанные раствором адгезива (NCL-BOND, фирмы «Novocastra», Великобритания) предметные стекла. Для высокотемпературной демаскировки антигенов применялся 0,01М цитратный буфер с рН 6,0. Стекла со срезами кипятились в скороварке под высоким давлением в течение 2 минут. Для блокирования эндогенной пероксидазы использовали свежеприготовленный 3%-й раствор перекиси водорода. После инкубации с нормальной неиммунной сывороткой на срезы наносили первые (специфические) антитела. Использовали антитела к РЭ - RTU-ER-6F1 l(«Novocastra»); к РП - RTU-PGR-312 («Novocastra»); к РА - AR441, в разведении 1:200 («DAKO»); антитела к антигену Ki-67 - RTU-Ki-67-MMl («Novocastra»); поликлональные кроличьи антитела к онкобелку c-erbB2 (HER-2) - А0485 («DAKO»), В качестве системы визуализации использовали ABC-kit («Novocastra»). Пероксидазу хрена, с помощью которой метились молекулы авидина, выявляли при помощи диамиобензидина. Проявление реакции контролировали под микроскопом. Затем препараты переводились в постоянные путем заключения в канадский бальзам (фирма «БиоВитрум»),

Анализ результатов проводили при помощи микроскопа DM LS2. фирмы «Leica». Использовали объектив с увеличением 10 или 20 и окуляр с увеличением 10.

Для оценки экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и андрогенов использовалась система Histochemical score (Hscore). При оценке иммуногистохимического окрашивания по способу HScore [McClelland R.A. et al., 1991] подсчитывали число ядер с разной интенсивностью окраски на 500 опухолевых клеток и окончательные результаты рассчитывали по формуле:

HScore = 1 x процент слабоокрашенных клеток +

2 х процент умеренноокрашенных клеток +

3 х процент сильноокрашенных клеток.

Экспрессию онкобелка HER-2 оценивали в соответствии с правилами HercepTest ™ (фирма «DAKO») в баллах от 0 до 3+.

Для оценки уровня экспрессии антигена Ki-67 подсчитывалось количество (%) положительно окрашенных ядер клеток независимо от интенсивности их окрашивания.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 5.0 for Windows 2000. Использовались корреляционный анализ по Спирмену и тест Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфологические, клинические и прогностические характеристики рака молочной железы в обследованной группе пациентов.

У подавляющего большинства пациентов (у 280 из 344), отмечался инвазивный протоковый РМЖ, что составило 81,3 %. Соотношение различных гистологических форм РМЖ не противоречило аналогичным данным ВОЗ [WHO, 2003]. При проведении сравнительного анализа между различными гистологическим формами рака молочной железы не выявлено достоверно значимых различий по следующим показателям: среднему возрасту пациента, размерам опухоли, наличию метастатического поражения лимфатических узлов, количеству пораженных метастазами лимфатических узлов (р>0,05; тест Манна-Уитни).

Практически с одинаковой частотой РМЖ обнаруживался в правой.(48,9 %) и левой (51,1 %) молочных железах.

Средний возраст пациентов составил 55±7,6 лет.

Коэффициент корреляции по Спирмену между показателями «средний возраст пациентов» и «степень злокачественности» составил г = - 0,89 (р< 0,05).

Группы пациентов с опухолями с различной степенью злокачественности статистически достоверно отличались друг от друга по показателю «множественности (больше 1) метастатического поражения лимфатических узлов» (р = 0,01). Чем выше степень злокачественности РМЖ, тем чаще метастазами были поражены два и более лимфатических узлов.

У пациентов обследуемой группы встречались опухоли различных размеров. Минимальный размер выявленной опухоли составил 0,7 см, максимальный — 15 см. С

помощью корреляционного анализа по Спирмену обнаружено, что размер опухоли прямо пропорционально коррелировал с возрастом пациентов (коэффициент корреляции по Спирмену г = 0,4; р <0,05). Также выявлена зависимость между количеством пораженных метастазами лимфатических узлов и размерами опухоли (коэффициент корреляции по Спирмену г = 0,32; р <0,05). Корреляция между количеством пораженных метастазами лимфатических узлов и возрастом обследуемых пациентов не обнаружена (р>0,05).

Представленные результаты в целом не противоречат данным литературы о взаимосвязи между степенью злокачественности РМЖ, возрастом пациента, размерами опухоли, наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы, количеством лимфатических узлов, пораженных метастазами [Волченко H.H., Франк Г.А., 2000]. Это позволяет рассматривать обследуемую группу пациентов как адекватную для анализа проведенных иммуногистохимических исследований.

Иммуногистохимическое определение содержания рецепторов эстрогенов и прогестерона в клетках рака молочной железы. Иммуногистохимическое определение содержания и уровня экспрессии РЭ и РП проведено в опухолях 344 пациентов с диагнозом РМЖ.

РЭ обнаружены в 48 % (в 164 из 344) случаев и отсутствовали в 52 % (в 180 из 344) случаев РМЖ.

Средний возраст пациентов с РЭ-положительными РМЖ составил 58,1 ±9,1 лет.

Корреляционный анализ по Спирмену в выборке (п = 344) обследованных пациентов с РМЖ показал, что возраст достоверно положительно коррелировал с уровнем экспрессии (HScore) РЭ (г = 0,3; р < 0,05), а также была выявлена обратная корреляция между уровнем экспрессии РЭ и размерами опухоли (г = - 0,35; р<0,05, по Спирмену).

Средний уровень экспрессии РЭ составил 202,4 балла по шкале Hscore при размахе изменчивости от 20 до 290. В зависимости от уровня экспрессии все РЭ-содержащие опухоли были разделены на три группы: с отрицательной (менее 10 баллов по шкале HScore), со слабоположительной (от 11 до 99 баллов по шкале HScore) и положительной (более 100 баллов по шкале HScore) экспрессией РЭ. Выделенные по уровню экспрессии РЭ в клетках РМЖ группы пациентов с помощью теста Манна-Уитни сравнивали между собой по следующим показателям: степени злокачественности РМЖ, возрасту пациента, размерам опухоли, количеству пораженных метастазами лимфатических узлов. Эти группы пациентов достоверно не различались между собой по всем вышеперечисленным показателям (р>0,05).

Наличие метастазов в регионарные лимфатические узлы отмечалось у 59 % пациентов с РЭ-отрицательными РМЖ, у 53 % пациентов с РЭ-слабоположительными опухолями и в 42 % случаев РМЖ с РЭ-положительным фенотипом. Наоборот, отсутствие метастазов в лимфатических узлах наблюдалось в 41 % случаев РЭ-отрицательных РМЖ, в 47 % случаев РЭ-слабоположительных РМЖ и в 58% случаев РЭ-положительных РМЖ. Таким образом, метастатическое поражение лимфатических узлов достоверно чаще отмечалось в группе пациентов с РЭ-отрицательными РМЖ (59 %), чем в группе пациентов с РЭ-положительными опухолями (42 %) (р < 0,05).

Множественное поражение лимфатических узлов отмечалось у 82 % пациентов с РЭ-отрицательными РМЖ, у 63 % пациентов с РЭ-слабоположительными опухолями и у 68 % пациентов с РЭ-положительными РМЖ. При сравнении выделенных по уровню экспрессии РЭ в клетках РМЖ групп пациентов выявлено, что множественное поражение лимфатических узлов достоверно чаще наблюдалось у пациентов с РЭ-отрицательными РМЖ, чем у пациентов с РЭ-слабоположительными и РЭ-положительными опухолями (р<0,05).

Таким образом, полученные нами результаты позволяют заключить, что наличие РЭ в опухоли является критерием более благоприятного клинического течения РМЖ.

Теперь рассмотрим в аналогичном порядке результаты изучения содержания РП в клетках РМЖ.

РП были выявлены в 43 % (в 148 из 344) случаев и отсутствовали в 57 % (в 196 из 344) случаев РМЖ.

Средний возраст пациентов с РП-позитивными РМЖ составил 51,61±7,9 лет. Напомним, что таковой показатель для РЭ-положительных РМЖ составил 58,1±9,1 лет. Тест Манна-Уитни выявил достоверность различий между средним возрастом пациентов с РЭ-положительными РМЖ (фенотип РЭ+) и средним возрастом пациентов с РП-положительными РМЖ (фенотип РП+) (р < 0,05).

Корреляционный анализ по Спирмену в выборке (п = 344) обследованных пациентов с РМЖ показал, что возраст пациентов достоверно обратно пропорционально коррелировал с уровнем экспрессии (НЗсоге) РП (г = —0,24; р< ,0,05).

Размеры РМЖ не зависели от экспрессии РП. Корреляционный анализ по Спирмену не выявил взаимосвязи между уровнем экспрессии РП и размерами опухолевого узла (г = - 0,09; р>0,05).

Средний уровень экспрессии РП составил 154,7 балла по шкале Шсоге при размахе изменчивости от 40 до 300. В зависимости от уровня экспрессии все РП-содержащие

опухоли были разделены на три группы: с отрицательной (менее 10 баллов), со слабоположительной (от И до 99 баллов) и положительной (более 100 баллов) экспрессией РП. Выделенные по уровню экспрессии РП группы пациентов с помощью теста Манна-Уитни сравнивали между собой по следующим показателям: степени злокачественности РМЖ, возрасту пациента, размерам опухоли, наличию метастазов и множественности поражения лимфатических узлов, количеству пораженных метастазами лимфатических узлов. Эти группы пациентов достоверно не различались между собой по всем перечисленным показателям (р>0,05).

В обследуемой нами выборке пациентов (п. = 344) выявлена положительная корреляция между уровнями экспрессии РЭиРП (г = 0,6; р < 0,01).

Обращает на себя тот факт, что опухоли, содержащие РП, чаще встречаются у более молодых пациентов, что свидетельствует о важности этого маркера, выявляемого иммуногистохимическим методом, и, поэтому, требует к себе пристального внимания.

Иммуногистохимическое определение содержания рецепторов андрогенов в клетках раке молочной железы. Иммуногистохимическое определение РА проводилось в опухолевых биоптатах, полученных от 74 пациентов с РМЖ. РА были обнаружены в 47 % (35 из 74) случаев. Количество РА-отрицательных фенотипов РМЖ составило 53 % (РА отсутствовали у 39 из 74 пациентов). На рис. 1 представлена частота встречаемости РА в клетках РМЖ у пациентов обследуемой группы.

Андроген-рецепторный статус рака молочной железы

Рис. 1. Соотношение андроген-рецепторных фенотипов рака молочной железы

Средний возраст пациентов с РА-положительными РМЖ составил 57,3± 12,4 лет. Тест Манна-Уитни не выявил достоверных различий между средним возрастом пациентов с РА-позитивными (фенотип РА+) и РЭ-положительными РМЖ (р>0,05), а также между средним возрастом пациентов с РА-положительными и РП-положительными РМЖ (р >0,05).

Уровень экспрессии РА в среднем составил 46,36 баллов по шкале Шсоге при размахе изменчивости от 20 до 200, что оказалось достоверно ниже уровня экспрессии РЭ (202,4 баллов по шкале НЭсоге) (р<0,01) и РП (154,7 баллов по шкале Шсогс) (р<0,05) (рис.2).

Рецепторы стероидных гормонов

Рис. 2. Средние уровни экспрессии (Шсоге) рецепторов андрогенов (РА), рецепторов эстрогенов (РЭ) и рецепторов прогестерона (РП) в клетках рака молочной железы.

Следует отметить, что все РА-отрицательные РМЖ имели вторую степень злокачественности. ____

Возрастные различия между пациентами с опухолевыми фенотипами РА+ и РА— оказались статистически недостоверными (р>0,05, тест Манна-Уитни). Между уровнем экспрессии РА и возрастом пациентов какие-либо корреляции не выявлены (г = 0,07; р>0,05). Опухоли с фенотипами РА+ и РА- не различались между собой по размерам (р > 0,05).

Выделенные по уровню экспрессии РА группы пациентов сравнивали между собой по следующим показателям: степени злокачественности РМЖ, возрасту пациента, размерам опухоли, наличию или отсутствию метастазов в лимфатических узлах, множественности метастатического поражения (>1 лимфатического узла), количеству

пораженных метастазами лимфатических узлов. Различия между группами пациентов по этим показателям оказались статистически недостоверными (р>0,05; тест Манна-Уитни,).

Корреляционный анализ по Спирмепу выявил, что уровень экспрессии (Щсоге) РА прямо пропорционально коррелировал с уровнем экспрессии (НБсоге) РЭ (г = 0,46; р < 0,01) и уровнем экспрессии (Шсоге) РП (г = 0,56; р < 0,01).

Таким образом, в результате проведенного исследования обнаружено, что РА содержались в 47 % случаев РМЖ. Уровень экспрессии РА в опухоли достоверно ниже, чем уровень экспрессии РЭ и РП (р<0,05 в обоих случаях).

Содержание и экспрессия рецепторов андрогенов в клетках рака молочной железы с различными РЭ- н РП-фенотипами. В начале этого раздела мы приведем анализ совместного содержания и уровня экспрессии РЭ и РП в РМЖ, а затем перейдем к рассмотрению вопроса о содержании и уровню экспрессии РА в РМЖ с различными РЭ/РП фенотипами.

В зависимости от наличия в опухоли РЭ и/или РП были выделены 4 группы пациентов с различными гормонально-рецепторными фенотипами РМЖ (рис.3).

Гормонально-рецепторные фенотипы опухолей

Рис. 3. Соотношение различных гормонально-рецепторных фенотипов рака молочной железы.

Совместная экспрессия РЭ и РП наблюдалась чаще (34 %), чем экспрессия РЭ без экспрессии РП (13 %) и экспрессия РП без экспрессии РЭ (9 %). Одновременное

отсутствие в клетках РМЖ обоих рецепторов наблюдалось в подавляющем большинстве случаев (44 %). Таким образом, совместная экспрессия РЭ и РП или ее отсутствие в РМЖ были доминирующими комбинациями наличия рецепторов.

Оказалось, что пациенты с опухолевым фенотипом РЭ+РП- достоверно старше пациентов с другими гормонально-рецепторными фенотипами РМЖ (р<0,05). У пациентов с РМЖ более старшего возраста чаще выявляются рецепторы эстрогенов, тогда как пациенты более молодого возраста чаще имеют опухолевый фенотип РЭ-РП+.

Между различными гистологическими типами РМЖ достоверные различия по уровню экспрессии РЭ и РП не выявлены (р>0,05, тест Манна-Уитни).

При сравнении выделенных четырех групп фенотпов РМЖ выявилось, что опухоли с более высоким уровнем злокачественности достоверно чаще встречались среди опухолей с фенотипом РЭ-РП-, чем с фенотипом РЭ+РП+ (р < 0,01).

В табл. 1 приведены данные о наличии частоте встречаемости метастатического РМЖ у пациентов с различными гормонально-рецепторными фенотипами РМЖ.

Частота встречаемости метастатического рака молочной железы у пациентов

с различными гормонально-рецепторными фенотипами опухолей

Характеристика метастатического процесса Гормонально-рецепторный фенотип рака молочной железы

РЭ+РП+ РЭ+РП- РЭ-РП+ РЭ-РП-

Отсутствие метастазов 59 50 , 30 65 9 30 30 20

Наличие метастазов 59 50* 16 35* 21 70* 120 80*

Всего 118 100 46 100 30 100 150 100

*- статистически достоверное отличиё (р < 0,05, тест Манна-Уитни).

Из табл. 1 следует, что у пациентов с фенотипами опухолей РЭ-РП- и РЭ-РП+ . достоверно чаще, чем у пациентов с опухолевыми фенотипами РЭ+РП+ и РЭ+РП-, встречался метастатический РМЖ (р < 0,05). Таким образом, можно заключить, что РМЖ с фенотипами РЭ-РП- и РЭ-РП+ характеризуются более злокачественным течением.

Следующим этапом нашего исследования стало ' изучение одновременной экспрессии РА и РЭ и/или РП в клетках РМЖ.

Совместная экспрессия в опухоли РА и РЭ (фенотип РА+РЭ+) отмечалась в 85,7 % случаев РМЖ. Только 14,2 % опухолей не содержали РЭ (фенотип РА+РЭ-). В табл. 2

представлены средние значения уровней экспрессии РА и РЭ в клетках РМЖ с различным РА-фенотипом опухоли.

Среднее значение уровня экспрессии рецепторов эстрогенов (РЭ) и рецепторов андрогенов (РА) в клетках рака молочной железы с различными РА-фепотипами опухолей

Рецепторы гормонов Уровень экспрессии рецепторов гормонов, НЗсоге

РА+РЭ+ РА+РЭ- РА-РЭ+ РА-РЭ-

РЭ 210±12* 0 96±3* 0

РА 101±47 117±49 0 0

*- статистически достоверное отличие (р < 0,001, тест Манна-Уитпи).

Уровень экспрессии РЭ в РА-отрицательных РМЖ (фенотип РА-) был достоверно (р < 0,001) ниже, чем в РА-положительных (фенотип РА+) опухолях. Экспрессия РА в клетках РМЖ с фенотипом РА+РЭ+ была почти вдвое ниже уровня экспрессии РЭ.

Совместная экспрессия в опухоли РП и РА (фенотип РА+РП+) отмечалась в 71,4 % случаев. Двадцать девять процентов опухолей не содержали РП (фенотип РА+РП-). В табл. 3 представлены средние значения уровней экспрессии РА и РП в клетках РМЖ с различными РА-фенотипами.

Среднее значение (НЗсоге) уровня экспрессии рецепторов прогестерона (РП) и

рецепторов андрогенов (РА) в клетках рака молочной железы с различными РА-фенотипами опухолей

Рецепторы гормонов Уровень экспрессии рецепторов гормонов, НЗсоге

РА+РП+ РА+РП- РА-РП+ РА-РП-

РП 166±73* 0 44±11* 0

РА 103±12 103±47 0 0

*- статистически достоверное отличие (р < 0,001, тест Манна-Уитни).

Уровень экспрессии РА оказался ниже уровня экспрессии РП в клетках РМЖ с • фенотипом РА+РП+. Уровень экспрессии РП в РА-отрицательных (фенотип РА-) РМЖ был достоверно (р < 0,01) ниже, чем в РА-положительных опухолях (фенотип РА+).

Среди РА-положительных РМЖ подавляющее большинство составили опухоли с фенотипом РЭ+РП+ (69 .%). Вторыми по частоте встречаемости стали опухоли, в

которых РЭ и РП отсутствовали (11 %). Реже всего (3 %) наблюдалась совместная экспрессия только Р А и РП в отсутствие РЭ (табл. 4).

Частоты встречаемости различных гормонально-рецепторных фенотипов рака молочной

Андроген-рецепторный статус РЭ+РП+ РЭ+РП- РЭ-РП+ РЭ-РП-

РА+ (п = 35) 24 69* 6 17* 1 3* 4 11*

РА-(п = 39) 6 15* 7 18* 2 5* 24 62*

*- статистически достоверное отличие (р < 0,001, тест Манна-Уитни).

Напротив, среди РА-отрицательных РМЖ большинство составили опухоли с фенотипом РЭ-РП- (62 %), причем частота их встречаемости оказалась очень близкой к частоте встречаемости фенотипа РЭ+РП+ в РА-положительных РМЖ. Совместная экспрессия РЭ, РП, РА (фенотип РЭ+РП+РА+) или их отсутствие (фенотип РЭ-РП-РА-) в РМЖ наблюдались достоверно чаще, чем в опухолях с другими фенотипами (р< 0,001; тест Манна-Уитни).

Экспрессия РА в опухолях с разными РЭ- и РП-фенотипами тоже была неодинаковой (табл. 5).

Среднее значение (ГОсоге) уровня экспрессии рецепторов андрогенов (РА) в клетках рака

молочной железы с различными РЭ/РП-фенотипами

Уровень экспрессии (Нвсоге) РЭ+РП+ РЭ+РП- РЭ-РП+ РЭ-РП-

РА 103±15* 72±1* 140* 123±2*

*- статистически достоверное отличие (р < 0,001, тест Манна-Уитни).

Тест Манна-Уитни выявил статистически достоверные различия по уровню экспрессии РА между опухолями с фенотипом РЭ-РП-РА+ и всеми остальными фенотипами РМЖ: РЭ+РП+РА+ (р < 0,001); РЭ+РП-РА+ (р <0,05); РЭ-РП+РА+ (р < 0,05). Кроме того, опухоли с фенотипами РЭ+РП+РА+ и РЭ+РП-РА+ различались между собой по этому показателю (р < 0,01).

Таким образом, представленные результаты показывают, что РА значительно и достоверно чаще встречаются в клетках РМЖ, содержащих РЭ и РП. Максимальная экспрессия РА отмечается в опухолях, не содержащих РЭ и РП. Основными гормонально-рецепторными фенотипами РМЖ являются те, в которых РА, РЭ и РП одновременно выявляются и не выявляются.

Иммуногистохимнческое определение экспрессии онкобелка HER-2 в клетках рака молочной железы. Определение экспрессии рецепторов HER-2 проводилось у 158 больных РМЖ, средний возраст которых составил 57,5±11 лет. Средний размер опухоли у пациентов обследуемой группы (п = 158) составил 2,4 см, при размахе изменчивости от 1 см до 11 см.

Данные о частоте встречаемости различных HER-2 фенотипов РМЖ представлены в табл. 6.

Частоты встречаемости различных HER-2 фенотипов рака молочной железы

Экспрессия онкобелка HER-2

0 баллов 1+ баллов 2+ баллов 3+ баллов

Количество пациентов п= 158 46 29 41 26 41 26 30 19

Различные ШЖ.-2 фенотипы опухолей встречались примерно с одинаковой частотой. Реже всех встречались опухоли с НЕЯ-2 (3+)-фенотипом (19 %).

Достоверные различия по возрасту между этими группами пациентов с различными НПЖ-2-фенотипами РМЖ выявлены не были (р>0,05).

У пациентов с опухолевыми фенотипами HER-2 (3+) и (2+) в отличие от пациентов с опухолевыми фенотипами ШЖ-2 (0) и (1+) достоверно чаще встречались множественные метастазы в лимфатических .узлах в сравнении с единичными метастатическими поражениями лимфатических узлов (р < 0,05; тест Манна-Уитни).

Средние значения Шсоте для РЭ, РП и РА в клетках РМЖ пациентов с различными ШЖ.-2-фенотипами опухолей представлены в табл. 7.

Уровень экспрессии (HScore) рецепторов эстрогенов (РЭ), рецепторов прогестерона (PIT)

и рецепторов андрогенов (РА) в опухолях с различными HER-2-фенотипами

Уровень экспрессии рецепторов стероидных гормонов, HScore HER-2

0 баллов 1+ баллов 2-1- баллов 3+ баллов

РЭ 128 (0-270) 162 (0-290) 140 (0-280) 112 (0-270)

РП 96* (0-300) 126* (0-290) 137* (0-300) 59* (0-280)

РА 97 (50-120) 123 (20-220) 116 (30-200) 70 (20-100)

*- статистически достоверные отличия (р< 0,05; тест Манна-Уитни).

Группы пациентов с различными ШЖ-2 фенотипами РМЖ не различались между собой по уровню экспрессии РЭ и РА (р>0,05). Вместе с тем, по уровню экспрессии РП были выявлены достоверные различия между обследуемыми группами пациентов с различными НЕЯ-2 фенотипами РМЖ. Стоит отметить тот факт, что опухоли с максимальной экспрессией НЕК-2 (3+) характеризуются достоверно пониженным уровнем экспрессии РП (р<0,01; тест Манна-Уитни).

Иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ю-67 в клетках рака молочной железы. Исследование пролиферативной активности клеток РМЖ проводилось иммуногистохимическим определением индекса Кл-67 в биоптатах, полученных из опухолей 344 пациентов с РМЖ. Индекс К-67 в клетках РМЖ колебался от 10 до 95 % и составил в среднем 41,4±18 %. Средний возраст пациентов, включенных в обследование, составил 55±7,6 лет. Уровень экспрессии антигена К>67 не зависел от возраста пациентов (корреляционный анализ по Спирмену, г = - 0,01; р> 0,05).

Распределение гистологических форм РМЖ не отличало данную обследуемую группу пациентов от других обследуемых групп.

Уровень экспрессии антигена К1-67 прямо пропорционально коррелировал со степенью злокачественности РМЖ (коэффициент корреляции по Спирмену г = 0,5; р< 0,001). Корреляционный анализ по Спирмену выявил, что размер опухоли зависел от уровня экспрессии антигена К.1-67 (коэффициент корреляции по Спирмену г = 0,42;

р < 0,05). Также была выявлена взаимосвязь между уровнем экспрессии антигена К\-67 и количеством пораженных метастазами лимфатических узлов (г = 0,28; р = 0,01).

Уровень экспрессии антигена Кд-67 положительно коррелировал с уровнем экспрессии онкобелка МЖ-2 (коэффициент корреляции по Спирмену г = 0,4; р < 0,05).

Показатели индекса К1-67 в клетках РМЖ с различными гормонально-рецепторными статусами представлены в табл.8.

Уровень экспрессии антигена К1-67 в клетках рака молочной железы с различными

Гормонапьно-рецепторные фенотипы рака молочной железы

РЭ+ РП+ РЭ+РП- РЭ-РП+ РЭ-РП-

Среднее значение антигена К-67, % 30*±14 3б±13 48*±19 52*±18

Всего п = 118 п = 46 ' п = 30 п= 150

* - статистически достоверное отличие (р<0,05, тест Манна-Уитни).

Уровень пролиферации (индекс К>67) клеток РМЖ с фенотипом РЭ-РП- был статистически достоверно выше, чем в клетках РМЖ с фенотипом РЭ+РП+ (р<0,01, тест Манна-Уитни). Аналогичные различия были выявлены между группами пациентов с опухолевыми фенотипами РЭ-РП+ и РЭ+РП+ (р<0,05, тест Манна-Уитни,). Эти результаты позволяют в целом характеризовать опухоли с фенотипами РЭ-РП- и РЭ-РП+, как имеющие неблагоприятный прогноз заболевания.

Индекс К1-67 отрицательно коррелировал с уровнем экспрессии РЭ (коэффициент корреляции по Спирмену г = - 0,47; р < 0,01) и РП (коэффициент корреляции по Спирмену г = - 0,44; р < 0,05). Какой-либо корреляции между уровнем экспрессии РА и антигена Кь 67 не обнаружено (р>0,05).

В зависимости от уровня экспрессии РЭ, РП и РА в клетках РМЖ пациенты были разделены на группы с отрицательной, слабоположительной и положительной экспрессией рецепторов стероидных гормонов. Статистически достоверных различий по индексу Кьб7 между РМЖ со слабоположительной экспрессией РЭ и РА, положительной экспрессией РЭ и РА, а также с РЭ- и РА-отрицательными опухолями пе выявлено (р>0,05). В то же время уровень экспрессии антигена Кь67 в клетках РМЖ со слабоположительными РП оказался достоверно выше, чем в опухолях с другим уровнем экспрессии РП (р < 0,05). Таким образом, стоит отметить, что РП-слабоположительные

РМЖ характеризуются не только высокой экспрессией онкобелка НЕ11-2, но и повышенной экспрессией антигена Кл-67.

1. Рецепторы андрогенов обнаруживаются в 47 % случаев рака молочной железы. Уровень экспрессии рецепторов андрогенов в опухоли достоверно. ниже, чем уровень экспрессии рецепторов эстрогенов и рецепторов прогестерона.

2. Содержание рецепторов андрогенов в клетках рака молочной железы связано с наличием рецепторов эстрогенов и прогестерона в опухоли. Рецепторы андрогенов выявляются в 69 % опухолей, имеющих рецепторы эстрогенов и прогестерона, и в И % опухолей, не содержащих рецепторы эстрогенов и прогестерона. Распространен вариант фенотипа рака молочной железы (32 %), когда в опухоли отсутствует весь комплекс стероидных гормонов.

3. Фенотипы рака молочной железы, характеризующиеся отсутствием рецепторов эстрогенов обладают более злокачественным течением. У пациентов с такими фенотипами опухолей достоверно чаще встречаются метастазы в регионарные лимфатические узлы.

4. Низкий уровень экспрессии рецепторов прогестерона в клетках рака молочной железы сочетается с высокими уровнями экспрессии антигена Кл-67, онкобелка НЕ11-2 в опухолевых клетках и является самостоятельным предсказательным критерием ответа на противоопухолевую гормональную терапию и показателем неблагоприятного прогноза клинического течения.

5. Максимальная экспрессия онкобелка НЕЯ-2 в клетках опухоли является независимым фактором прогноза клинического течения рака молочной железы, связана с высоким метастатическим потенциалом опухоли и с одинаковой частотой встречается в различных гормонально-рецепторных фенотипах рака молочной железы.

1. Для определения прогноза клинического течения рака молочной железы рекомендуется комплексное иммуногистохимическое определение уровня экспрессии рецепторов стероидных гормонов: эстрогенов, прогестерона и андрогенов в сочетании с определением уровня экспрессии онкобелка НЕЯ-2 и антигена К1-67 в клетках рака молочной железы.

2. При определении уровня экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона в клетках рака молочной железы следует обращать особое внимание на опухоли, не имеющие рецепторы эстрогенов и прогестерона или содержащие только рецепторы прогестерона, а также те, в которых независимо от уровня экспрессии рецепторов эстрогенов отмечается снижение уровня экспрессии рецепторов прогестерона, так как такие фенотипы рака молочной железы характеризуются более агрессивным злокачественным течением и являются неблагоприятными в плане ответа на гормонотерапию.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аникеева Н.В. Сравнительное изучение эффективности иммуноцитохимического метода определения рецепторов стероидных гормонов в раке молочной железы//Материалы Международной научно-практической конференции «Современные проблемы морфологической диагностики опухолей», Иркутск, 2003, 25-29 августа.-Иркутск,2003- С.120 (соавт.: Эллиниди В.Н., Гончарова O.A., Новик В.И.).

2. Аникеева Н.В. Изучение прогностической значимости иммуногистохимического определения рецепторов эстрогенов и прогестерона в раке молочной ■ железы //Материалы Международной научно-практической конференции «Современные проблемы морфологической диагностики опухолей», Иркутск, 2003, 25-29 августа.-Иркутск, 2003.-С.120 (соавт.: Эллиниди В.Н., Гончарова O.A.).

3. Ellinidi V.N., Anikeeva N.V., Goncharova O.A., Krasnozhon D.A. The NK cell (CD56, CD16) and Ki-67 antigen in ER/PR negative human breast cancer// Abstracts of 401 International Congress on Autoimmunity, Budapest, 2004, November 3-7 — Budapest, 2004.-P. 90-91.

4. Аникеева H.B. Иммуногистохимическое исследование рецепторов эстрогенов и прогестерона в раке молочной железы//Вопросы онкологии. - 2004. -Т.50.-№ 2.-С.234-236 (соавт.: Эллиниди В.Н., Гончарова O.A., Красножон Д.А., Федоров К.А.).

5. Аникеева Н.В. Сравнительный анализ пролиферативной активности рака молочной железы с различным эстроген-прогестероновым статусом/ЛВопросы онкологии.-2005.-Т.51 .-№ 2.-С.197-199 (соавт.: Эллиниди В.Н., Гончарова O.A., Красножон Д.А.).

6. Anikeeva N.V., Kravzov V.Y., Ellinidi V.N. Peculiarities of Estrogen and Progesterone Receptor Expression in Breast Cancer// Proceedings of Endocrine Treatment and Prevention of Breast and Gynaecological Cancers, Brüssel, 2006, January 26-28.-Brussel, 2006.-P.175.

7. Anikeeva N.V., Kravzov V.Y., Ellinidi V.N. Immunohistochemical Investigation of Expression of Oncoprotein HER-2 in Breast Cancer with Various Estrogen-Progesterone Statuses// Proceedings of Endocrine Treatment and Prevention of Breast and Gynaecological Cancers, Brüssel, 2006, January 26-28/-Brüssel, 2006.-P.174.

Выражаю искреннюю благодарность

моим научным руководителям - начальнику НИО морфологии и клеточной патологии сектора клинического лабораторно-диагностического ФГУЗ ВЦЭРМ МЧС России доктору биологических наук Кравцову Вячеславу Юрьевичу, начальнику лаборатории морфологических исследований сектора клинического лабораторно-диагностического ФГУЗ ВЦЭРМ МЧС России кандидату медицинских наук Эллиниди Вере Николаевне,

врачам Ленинградского и Псковского областных онкологических диспансеров и лично заведующей поликлиническим отделением Ленинградского областного онкологического диспансера Гончаровой Ольге Александровне,

главному научному сотруднику сектора клинического лабораторно-диагностического ФГУЗ ВЦЭРМ МЧС России доктору медицинских наук

профессору Наталии Михайловне Калининой,

коллективу лаборатории морфологических исследований ФГУЗ ВЦЭРМ МЧС России за помощь в подготовке диссертационной работы, внимание и поддержку.