Наносистемы на основе амфифильных полимеров для доставки биологически активных веществ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ
доктор химических наук, профессор Ямсков И.А. кандидат химических наук, в.н.с. Ямпольская Г.П.
Ведущая организация: Российский Химико-Технологический Университет им. Д.И. Менделеева
Защита состоится "24" мая 2005 г. в 16 00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Автореферат разослан апреля 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат химических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Создание супрамолекулярных структур нано'метровых размеров является одной из важнейших задач современной химии. Известно, что амфифильные полимеры способны формировать самоорганизующиеся наноструктуры за счет наличия в их цепи гидрофобных и гидрофильных фрагментов. Благодаря своим физико-химическим свойствам, амфифильные полимеры привлекают внимание исследователей не только в фундаментальном, но и прикладном аспекте. Полимерные наночастицы на основе амфифильных полимеров вызывают все возрастающий интерес в фармакологии, так как они представляют один из видов терапевтических систем способных транспортировать лекарственные вещества внутрь клеток. При циркуляции таких наноносителей содержащееся в них биологически активное вещество (БАВ) защищено от инактивации, а действие лекарственного препарата пролонгируется. Кроме того, преимуществами таких систем являются их быстрое и воспроизводимое получение в больших количествах, возможность включения в полимерные наночастицы плохорастворимых в воде веществ и регулирования накопления полученных препаратов в различных органах и тканях организма в зависимости от размера частиц. В этой связи, очевидно, что разработка и исследование наносистем доставки БАВ на основе амфифильных полимеров является актуальным и перспективным направлением современной биотехнологии.
Цель и задачи исследования. Данная работа направлена на создание полимерных наносистем для доставки БАВ на основе двух новых амфифильных полимеров: декстран-поли-8-капролактона (Dex-PCL) и стеароил-поли^-винилпирролидона (ПВП-стеар). В работе были поставлены следующие задачи:
1) исследовать строение и основные свойства амфифильных полимеров Dex-PCL и ПВП-стеар;
2) разработать методы получения наночастиц из указанных амфифильных полимеров;
3) изучить физико-химические свойства и строение полученных наночастиц различными методами и исследовать возможность их биодеградации,
4) получить и изучить свойства наночастиц, содержащих БАВ;
5) исследовать взаимодействия наночастиц с компонентами крови.
Научная новизна. В данном цикле исследований впервые получены и охарактеризованы наночастицы на основе амфифильных Dex-PCL и ПВП-стеар, а также смешанные наночастицы Dex-PCL/ПВП-стеар. Детальные физико-химические исследования с использованием современных методов, таких как импульсная 'Н-ЯМР спектроскопия высокого разрешения и электронная микроскопия замороженных сколов привели к выводу о том, что Dex-PCL наночастицы представляют собой устойчивые сферические образования с выраженной структурой «ядро-оболочка», где оболочкой являются цепи Dex, наночастицы из ПВП-стеар являются агрегатами мицелл; для смешанных наночастиц характерна поверхностная модификация частиц Dex-PCL цепями ПВП. Впервые исследована деградация Dex-PCL наночастиц двумя ферментами -декстраназой и липазой, что позволило оценить возможности биодеструкции созданных наносистем in vitro. Впервые показано, что наночастицы на основе Dex-PCL и ПВП-стеар способны с высокой эффективностью включать БАВ различной природы тамоксифен (плохо растворимый противоопухолевый лекарственный препарат) и соевый ингибитор протеиназ типа Баумана-Бирк (BBI) (препарат белковой природы, обладающий противовоспалительным и антиканцерогенным действием). Установлено, что включенные в наночастицы белки защищены от инактивации Кроме того, возможно полное высвобождение БАВ в определенных условиях Впервые проведено детальное изучение влияния наночастиц Dex-PCL и ПВП-стеар как на систему комплемента сыворотки крови, так и на мембрану эритроцитов. Обнаружена высокая стабильность полимерных наночастиц из Dex-PCL и ПВП-стеар в сыворотке крови человека Выявлено отсутствие активации системы комплемента наночастицами из ПВП-стер, а также снижение лизиса эритроцитов смешанными наночастицами Dex-PCL/ПВП-стеар по сравнению с Dex-PCL наночастицами
Практическая значимость работы. Проведенное систематическое исследование показало перспективность использования таких амфифильных полимеров, как ПВП-стеар и Dex-PCL, для создания супрамолекулярных частиц нанометровых размеров. Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что наночастицы ПВП-стеар и Dex-PCL можно успешно использовать в качестве систем доставки различных БАВ. На основании совокупности экспериментальных данных предложен ряд практических применений наносистем на основе исследованных амфифильных полимеров:
- резкое увеличение концентрации плохорастворимых в воде веществ;
- предотвращение инактивации белковых препаратов, включенных в наносистемы и увеличить их биодоступность;
- получение наносистем с контролированным высвобождением.
Все выявленные в ходе работы особенности полученных наносистем на основе амфифильных полимеров являются фундаментальными при внедрении в практику современных биотехнологических исследований.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (Москва, 2005), XII Int. BRG Workshop on Bioencapsulation (Vitoria, Spain, 2004), European Conference on Drug Delivery and Pharmaceutical Technology (Sevilla, Spain, 2004), 4th international postgraduate research symposium on pharmaceutics (Istanbul, Turkey, 2004), Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов фонда И.В. Березина. "Инженерная энзимология", (Москва, 2003), 1st EUFEPS Conference on "Optimising Drug Delivery and Formulation", (Paris/Versailles, France, 2003), Конференции Биокатализ-2002 (Москва, 2002), 3th International postgraduate research symposium on pharmaceutics (Istanbul, Turkey, 2002), V Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2002), The Symposium of 13th Microencapsulation, (Angers, France, 2001), Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки к новым технологиям: Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок: экологически безопасные технологии» (Москва, Тверь, 2001).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Главы 1-4), экспериментальной части (Глава 5), результатов и их обсуждения (Главы 6-10), выводов и списка цитируемой литературы (256 ссылок). Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, включает 65 рисунков и 19 таблиц.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
1. Исследование строения и основных свойств амфифильных производных декстрана и поливинилпирролидона.
В качестве амфифильных полимеров для получения наночастиц в работе использовали привитые блок сополимеры декстран-поли-е-капролактона (Бех-РСЬ, с содержаним декстрана в сополимере 10 - 33 %, синтезированные в лаборатории проф. П. Куврера, Университет Париж - Юг 11) и блок сополимеры стеароил-поли-К-винилпирролидона различных молекулярных масс (ПВП-стеар, Мп= 1500, 2100, 3500, 4000, 5500 - препараты, полученные в лаборатории проф. Штильмана М.И., РХТУ им. Д.И. Менделеева) (рис. 1).
Рис. 1. Структура амфифильного ПВП-стеар (А) и Бех-РСЬ (Б).
Структура сополимеров Бех-РСЬ и ПВП-стеар была изучена методом ЯМР спектроскопии высокого разрешения на ядрах 13С и 1Н (400 МГц). Химические сдвиги и интегралы совпадали с расчетными, полученными, исходя из химических формул и молекулярных масс соединений. Определены значения критических концентраций агрегации (ККА) полимеров методом, основанным на солюбилизации водонерастворимых флуоресцентных красителей; полученные значения находятся в диапазоне 10-4 - 10-6 М (Таблица 1).
Значения ККА амфифильных полимеров.
Сополимер ПВП-стеар ЮСА, 10° М Сополимер Эех-РСЬ ККА, 10° М
Молекулярная 2000 10,0 Содержание
масса, (Мл) 2600 10,0 цепей Бех, % 23 0,33
* нерастворим в воде
2. ПВП-стеар и Dex-PCL наночастицы: получение и свойства 2.1. Получение полимерных наночастиц
Наночастицы из ПВП-стеар, Dex-PCL и их смесей были получены с использованием методов прямого растворения, диализа и эмульсионного метода.
Наночастицы визуализированы при помощи трансмиссионной (ТЭМ) и сканирующей (СЭМ) электронной микроскопии (рис. 2).
Рис. 2. (А) - ТЭМ микрофотографии наночастиц ПВП-стеар Мп=2600, полученных диализным методом; (Б) - СЭМ микрофотографии Dex33-РСL наночастиц, полученных прямым растворением; (В) - СЭМ микрофотографии Dexio-PCL наночастиц, полученных эмульсионным методом; (Г) - СЭМ микрофотографии смешанных наночастиц Dex10-PCL/ПВП-стеар 5500, полученных эмульсионным методом.
Данные электронной микроскопии, наряду с результатами динамического светорассеяния позволили сделать следующие выводы 1) средний размер всех наночастиц, полученных методом диализа и эмульсионным методом, был меньше среднего размера наночастиц, полученных прямым растворением сополимеров, 2) для наночастиц, полученных эмульсионным методом, характерно более узкое распределение по размерам и соответственно более низкий индекс полидисперсности (И П), 3) на процессы самосборки амфифильных молекул существенное влияние оказывают свойства растворителей (полярность и ионная сила раствора) Эти закономерности, скорее всего, определяются кинетическими параметрами процесса самоорганизации амфифильных полимерных молекул при разных способах получения наночастиц
Рис 3 Средний диаметр ПВП-стеар (А) и Dex-PCL (Б) наночастиц, полученных эмульсионным методом, растворитель этилацетат (у соответствующего столбца показан диапазон изменений размеров наночастиц)
Наибольший практический интерес представляет эмульсионный метод получения наночастиц Данный метод экспрессен, позволяет варьировать свойства наночастиц за счет большого количества факторов (таких как природа используемого растворителя, соотношение водной и органической фазы, время и мощность ультразвукового воздействия, а также концентрация сополимера) Кроме того, метод применим к большому количеству полимерных молекул, обладающих как слабо, так и сильно выраженными гидрофобными свойствами В связи с вышеизложенным, в ходе дальнейшей работы наночастицы получали
эмульсионным методом, а в качестве растворителя использовали этилацетат. Размеры полученных эмульсионным методом наночастиц приведены на рис. 3 Отметим, что для частиц ПВП-стеар, полученных эмульсионным методом, наблюдался довольно высокий индекс полидисперсности. Это было вызвано присутствием в смеси значительного количества частиц, отвечающих мицеллярной форме ПВП-стеар наночастиц, диаметром
25 нм. Данный размер совпадает с рассчитанным размером мицелл, образованных ПВП-стеар.
2.2. Характеристика полимерных наночастиц
Методом, основанным на измерении электрофоретической подвижности наночастиц, были определены! ¿¡-потенциалы полученных наночастиц (рис 4).
Обнаруженное уменьшение ¿¡-потенциала по абсолютной величине для Dex-PCL наночастиц с возрастанием содержания Dex свидетельствует об экранировании цепями декстрана отрицательно заряженного поли-е-капролактонового ядра наночастицы. (¿¡-потенциал PCL наносфер составлял -45 мВ). ¿¡-потенциал ПВП-стеар наночастиц, а также смешанных полимерных наночастиц Dex^-PCL/ПВП-стеар был более положительным, чем у частиц Dex10-PCL. Уменьшение значения ¿¡-потенциала по абсолютной величине для смешанных наночастиц, образованных полимером ПВП-стеар (Мп 5500), по
сравнению с ПВП-стеар (Мп 3000), связано с тем, что ПВП-стеар с Мп 5500 обладает большей гидрофильной ПВП составляющей. По всей видимости, ПВП цепи экранируют отрицательно заряженное ядро поликапролактона, что свидетельствует в пользу образования смешанных полимерных наночастиц с ПВП оболочкой.
Новым подходом для изучения структурной организации наночастиц из амфифильных полимеров является метод ядерного магнитного резонанса.
Рис. 5. Н-ЯМР спектр сополимера Бех10-РСЬ в ДМСО-ё6 (А) и наночастиц из него в Б20 (Б).
На рис. 5 приведены Н-ЯМР для сополимера Dex10-PCL в растворе ДМСО-d6 - селективном растворителе для обоих блоков, и для наночастиц в D2O. При сравнении спектров видно, что пики, соответствующие протонам PCL в наночастицах, стали более уширенными, а пики, соответствующие протонам декстрановой цепи, по интенсивности становятся сопоставимы с пиками протонов PCL. Следовательно, в наночастицах PCL цепи становятся менее доступными растворителю, составляют ядро наночастиц и находятся при этом в кристаллическом или жидкокристаллическом состоянии.
Сравнивая спектры ПВП-стеар в ДМСО^б и наночастиц в D2O можно было отметить исчезновение пиков, относящихся к концевой стеароильной группе. Смещение пиков в сторону больших химических сдвигов, а также большая интенсивность и выраженность пиков, отвечающих ПВП части, свидетельствовала о практически полном экранировании гидрофобной углеводородной цепи стеароила поли-К-винилпирролидоновыми цепями. Из 'Н-ЯМР спектров для смешанных наночастиц не удалось сделать какие-либо выводы о структуре из-за наложения основных химических сдвигов для ПВП и PCL.
2.3. Устойчивость дисперсии наночастиц на основе ПВП-стеар и Dex-PCL
Одной из важных характеристик полимерных наночастиц является их устойчивость. Методом динамического светорассеяния были оценены размеры наночастиц ПВП-стеар 2600 до и после фильтрации на 0,22 мкм фильтре Миллипор. Под действием внешнего давления размер частиц после фильтрации составляет приблизительно 200 нм, т.е. сопоставим с размером пор фильтра. При этом концентрация полимера в растворе после фильтрации не изменяется. Затем частицы, полученные после фильтрации, были подвергнуты 15 секундному ультраозвучиванию. Разумно было бы предположить, что произойдет разрушение полимерных частиц, однако наблюдалась обратная картина - размер частиц стал таким как был до фильтрации. Т.е. размер
300 нм для полученных ПВП-стеар наночастиц является наиболее термодинамически выгодным. Отметим, что система также может прийти к равновесию и самопроизвольно: спустя 30 минут наночастицы приобретают прежний размер. Из полученных экспериментальных
данных можно сделать вывод, что данные наночастицы состоят из агрегатов амфифильного полимера меньшего размера и являются агрегатами мицелл ПВП-стеар (ё=25 нм). Эксперименты, проведенные для наночастиц из Бех-РСЬ, показали, что через фильтр проходят только те частицы, размер которых меньше диаметра пор фильтра.
Агрегация коллоидных частиц электролитами занимает важное место среди дестабилизирующих факторов системы. Электролит влияет на свойства двойного электрического слоя (ДЭС), в результате чего происходит уменьшение электростатического отталкивания частиц. В ходе работы были получены экспериментальные зависимости электрокинетического потенциала Бех-РСЬ наночастиц от концентрации вводимого в систему электролита (КаС1). Из зависимости 1п Й1(ге^4кбТ) от значения к - эффективной ионной атмосферы (параметра Дебая) была рассчитана - толщина повышенной вязкости сжимаемой части ДЭС, которая составила: 3; 8; 9 нм для наночастиц, образованных Оехю-РСЬ, Оехгз-РСЬ, Оехзз-РСЬ соответственно. Если предположить, что внешнюю оболочку наночастиц составляют цепи декстрана, то можно с уверенностью сказать, что величина Д хорошо коррелирует с толщиной декстрановой оболочки: увеличение содержания цепей декстрана в сополимере ведет к увеличению А. При дальнейшем увеличении ионной силы (выше 200 мМ) наночастицы Бех-РСЬ теряют свою агрегативную устойчивость. Наночастицы ПВП-стеар были более устойчивыми к процессам агрегации и не агрегировали до концентрации КаС1 0,5 М и выше.
Важным параметром, влияющим на процессы, протекающие в суспензии наночастиц, является температура. Для Бех-РСЬ наночастиц показано, что их размер при нагревании практически не изменяется. Увеличение температуры раствора до 70°С в среднем приводит к увеличению размера наночастиц на 10 -15%. Данные результаты говорят в пользу того, что Бех-РСЬ наночастицы имеют жесткую устойчивую структуру. В свою очередь, увеличение температуры для наночастиц, образованных амфифильным ПВП-стеар, приводит к уменьшению их размера (рис. 6).
25 35 45 55 65 75
Рис. 6. Температурная зависимость размера наночастиц амфифильного ПВП-стеар (Мп 3000) в физиологическом растворе.
При этом данный процесс является обратимым. Размер наночастиц при 1 > 70°С, приближается к размеру мицелл данного полимера. Этот результат подтверждает высказанную ранее гипотезу о том, что рассматриваемые наночастицы являются агрегатами частиц меньшего размера (мицелл).
Исходя из совокупности экспериментальных данных, можно сделать вывод, что амфифильные полимеры Бех-РСЬ и ПВП-стеар пригодны для создания полимерных частиц нанометровых размеров. Разработанные методики получения наночастиц позволили варьировать распределение наночастиц по размерам. Показана возможность изменения электрокинетического потенциала наночастиц в зависимости от состава полимера и структуры частиц, а также при увеличении ионной силы раствора. Отметим, что полученные наночастицы в физиологических условиях являются устойчивыми коллоидными образованиями. Привлечение новейших методов, таких как импульсная Н-ЯМР спектроскопия высокого разрешения и микроскопия замороженных сколов, наряду с другими методами исследования, позволили высказать предположение о структуре полученных частиц: 1) Бех-РСЬ наночастицы представляют собой устойчивые сферические образования с выраженной структурой «ядро-оболочка», где оболочкой являются цепи Бех; 2) наночастицы из ПВП-стеар, по всей видимости, являются агрегатами мицелл; 3) для смешанных наночастиц характерна поверхностная модификация частиц Бех-РСЬ цепями ПВП (рис. 7).
1) Бех-РСЬ 2) ПВП-стеар 3) Бех-РСЬ/
«Ядро-оболочка» «Агрегаты мицелл» «Поверхностная
Рис. 7. Схематическое представление структуры полученных полимерных наночастиц.
3. Ферментативная деградация Dex-PCL наночастиц
Одним из новых и мало изученных направлений в исследовании различного рода полимерных наночастиц являются методы их ферментативной деградации. Данный подход применим не только для деградации частиц, образованных природными макромолекулами, но и для ряда синтетических полимеров, которые, строго говоря, не являются специфическими субстратами для ферментов. В том случае, когда исследуемая система полностью состоит из биодеградируемых полимеров, данный метод позволяет не только определить возможность биодеструкции полимерных носителей в организме, но и предсказать основные фармакокинетические параметры наносистемы доставки БАВ. Dex-PCL является полностью биодеградируемым полимером, в связи с этим, в работе были изучены параметры ферментативной деградации наночастиц на основе Dex-PCL декстраназой и липазой, ведь известно, что данные ферменты присутствуют в организме человека и животных.
3.1. Деградация Dex-PCL наночастиц декстраназой
Наночастицы подвергали ферментативной деградации декстраназой из PeniciШum sp. Деградацию оценивали по содержанию декстрана в супернатанте (Dex (супернатант)) и в осадке ((Dex (осадок)), после инкубации наночастиц с декстраназой и центрифугирования. Определенное нами максимальное
относительное количество декстрана в супернатанте после деградации декстрановых цепей наночастиц, состоящих из Бех10-РСЬ, составил 37 % (рис. 8).
Рис. 8. Относительное содержание декстрана в супернатанте (•) и осадке (•), после деградации Бех]0-РСЬ наночастиц декстраназой ([Е]0= 3,75х10-7 М, 0,05 М ацетатный буфер, рН 5,5, 37°С).
При увеличении содержания цепей декстрана максимальный процент деградации декстрановых цепей возрастал до 60 и 81% для Бех23-РСЬ и Бех33-РСЬ, соответственно. Полученные результаты хорошо согласуются с расчетами, сделанными, исходя из предположения, что декстраназа способна выщеплять и переводить в супернатант лишь свободные от модификации поликапролактоном глюкопиранозные цепи декстрана.
Было обнаружено, что в процессе деградации наночастицы Бех-РСЬ увеличиваются в размерах. Так, за 120 мин деградации наночастиц Бехю-РСЬ, за счет агрегации, их диаметр изменяется от 200 до 900 нм. Агрегация, скорее всего, вызвана быстрой потерей декстрановой оболочки наночастиц в первые часы деградации с последующим слипанием поликапролактоновых ядер и образованием крупных сферических агрегатов (показано метом электронной микроскопии). При этом также предполагается, что фермент (декстраназа), сорбированный на оболочке наночастиц, является дополнительным связующим звеном между наночастицами. Изучение ¿[-потенциала наночастиц в процессе деградации показало, что -потенциал уменьшается по мере инкубации
наночастиц с декстраназой и, приближается к потенциалу поликапролактонового ядра. Таким образом, спустя 48 часов деградации, наночастицы практически полностью теряют декстрановую оболочку. Результаты 'Н-ЯМР спектроскопии наночастиц после деградации декстраназой свидетельствовали об уменьшении интенсивности пиков протонов, соответствующих цепям декстрана, т.е. цепи декстрана являются доступными при ферментативной деградации декстраназой.
3.2. Деградация Dex-PCL наночастиц липазами
Проведен скрининг липаз различной природы. Эффективность действия липазы определяли по скорости уменьшения мутности (D420) суспензии наночастиц в ходе ферментативной деградации. Исходя из полученных данных по ферментативной деградации наночастиц, была выбрана липаза из Pseudomonas sp, обладающая высокой активностью по отношению к PCL. За 10 минут деградации при микромолярной концентрации фермента происходило полное разрушение наночастиц. Скорость разрушения наночастиц, образованных полимером с меньшим содержанием цепей декстрана, была выше. Такие результаты могут быть объяснены, исходя из структуры наночастицы. Так как ферментативный гидролиз липазой обычно осуществляется на границе раздела фаз, то следует ожидать снижения скорости реакции, обусловленного увеличением Dex оболочки для наночастиц Dex33-PCL и Dex33-PCL, препятствующей проникновению фермента к субстрату (рис. 9).
Рис. 9. Кинетика деградации наночастиц Dex-PCL липазой из Pseudomonas sp., [Е]0= 6,25х10-6 М, [S]o=l,5x10-5 M.
Рис. 10. Ы-ЯМР спектр Бех23-РСЬ наночастиц в ДМСО-ёб после их деградации липазой.
По данным ЯМР спектроскопии (рис. 10) после деградации наночастиц липазой пики протонов, соответствующие цепям поликапролактона, распадаются на множество дополнительных пиков с другими значениями химических сдвигов. Наблюдается появление пика, обладающего высоким значением химического сдвига (пик 7,24), отвечающего протонам концевых карбоксильных и гидроксильных групп, которые образуются в большом количестве при деградации поликапролактона липазой. Таким образом, основные пики на спектре соответствуют продуктам расщепления поликапролактона (олигомерам капролактона и НО-(СН2)5-СООН).
Метод электронной микроскопии замороженных сколов позволил сделать вывод, что в процессе деградации наночастиц происходит разрушение крупных и образование небольших частиц размером 30-60 нм. Раствор, полученный после деградации наночастиц липазой, был отфильтрован на 0,22 мкм фильтре Миллипор и проанализирован методом динамического светорассеяния. Данные эксперимента показали, что раствор содержит наночастицы, средний диаметр
которых составляет 50± 10 нм. Отметим, что наночастицы такого размера не наблюдались после фильтрации наночастиц до деградации.
4. Наночастицы ПВП-стеар и Бех-РСЬ с включенными БАВ
4.1. Оех-РСЬ наночастицы с включенным ВВ1
Для получения наночастиц с включенным белком (ВВ1) использовали метод двойного эмульгирования. Эффективность включения белка в наночастицы определяли как отношение содержания белка в наночастицах к количеству белка взятому для капсулирования. Показан высокий процент включения модельного белка в полимерные наночастицы (рис. 11 А). По данным динамического светорассеяния при включении ВВ1 в наночастицы их средний размер уменьшался. Это связано с изменением структуры наночастиц, вызванным образованием новых гидрофобных взаимодействий при включении белка. 1Н-ЯМР спектроскопия наночастиц с включенным ВВ1 выявила наличие пиков, соответствующих протонам белка.
Оех,0-РСЬ Оех23-РСЬ Оех„-РСЬ 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Рис. 11. Эффективность включения ВВ1 в Оех-РСЬ наночастицы (А) и кинетика высвобояздения ВВ1 из Юехю-РСЬ наночастиц (Б) в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,4; 37°С) ( ■); в 0,05 М ацетатном буфере (рН 5,5; 37°С) в отсутствие (А) и в присутствии декстраназы ([Е]0= 7,5х10*7 М) (•).
После 48 часов инкубации при рН 7,4 из наночастиц Бех10-РСЬ наблюдается высвобождение 80 % белка (рис. 11 Б), а дальнейшее инкубирование наночастиц в фосфатном буфере сопровождается очень медленным накоплением ВВ1 в
растворе. Под действием декстраназы при рН 5,5 полное высвобождение белка из наночастиц происходило за 24 часа. При этом активность высвободившегося ВВ1 составила 82 %, что говорит об устойчивости белка к процессам включения и деградации
4 2 ПВП-стеар наночастицы с включенным ВВ1
Прежде всего, отметим, что из литературных данных известно, что ПВП обладает высокой адсорбирующей способностью и склонностью к комплексообразованию. В связи с этим в настоящей работе различными методами (электрофорез, гельпроникающая хроматография, вторые производные спектра УФ поглощения) было показано комплексообразование ВВ1 с амфифильным ПВП при низких концентрациях (С<ККА), когда он не образует каких-либо частиц в водной среде.
Для получения наночастиц ПВП-стеар с включенным ВВ1 полимер и белок непосредственно растворяли в воде. При концентрации ПВП-стеар 0,5 мг/мл удалось получить наночастицы с концентрацией ВВ1 2,0 мг/мл при эффективности включения 100 %. Дальнейшее увеличение концентрации ВВ1 в системе приводит к постепенному уменьшению эффективности включения белка и нецелесообразно. Высокий процент включения можно объяснить, комплексообразованием полимера и белка. С увеличением содержания ВВ1 Б полимерных наночастицах от 0,5 до 2,0 мг/мл, размер частиц уменьшается от 430 до 300 нм. Вероятно, присутствие белка определенным образом компактизует и упорядочивает строение коллоидных частиц. Методом электронной микроскопии было показано, что образующиеся частицы имеют сферическую форму.
В зависимости от концентрации полимера в системе исследовали активность ВВ1 (рис 12) При высокой концентрации полимера в смеси, белок активностью не обладает, но при уменьшении концентрации полимера его активность восстанавливается до исходной. Отсутствие активности ВВ1 при высоком содержании ПВП-стеар в смеси, в первую очередь, может быть связано с экранированием в наночастицах активного центра ВВ1 цепями полимера, предотвращающими взаимодействия ВВ1 с химотрипсином.
Рис. 12 Выявление скрытой антихимстриптической активности ВВ1 при разрушении наночастиц.
Для повышения растворимости олеилированного ингибитора ((оле)2ВВ1) мы исследовали возможность включения данного препарата в наночастицы на основе ПВП-стеар. При включении гидрофобизованных препаратов ВВ1 было показано, что с увеличением содержания (оле)2ВВ1 в смеси от 0,5 до 1,5 мг/мл, при постоянной концентрации ПВП-стеар (0,5 мг/мл), средний размер частиц уменьшается от 240 нм до 30 нм. При этом полученный размер частиц (30 нм) соотносится с размером мицеллы для данного полимера. В работе было исследовано влияние низких значений рН раствора на сохранение активности (оле)2ВВ1, включенного в полимерные частицы (рис. 13).
После высвобождения из наночастиц
Рис. 13. Сохранение антитриптической активности препарата (оле)2ВВ1 в присутствии и отсутствие ПВП-стеар, после инкубирования образцов в течение 24 и 48 часов при рН 1,4: I - (оле)2ВВ1 (0,1 мг/мл) , II - ПВП-стеар (0,5 мг/мл) + (оле)2ВВ1 (0,5 мг/мл), III - ПВП-стеар (0,5 мг/мл) + (оле)2ВВ1 (1,5 мг/мл).
Как видно, препарат (оле)2ВВ1 в течение 24 часов теряет 80 % антитриптической активности, а за двое суток полностью инактивируется (рис. 13,1). Однако включение белка в полимерные агрегаты способствует сохранению его активности при низких значениях рН (рис. 13, II). При определенном соотношении концентраций препарата (оле)2ВВ1 и ПВП-стеар, происходит перестройка полимерных агрегатов с образованием мицелл, полностью солюбилизирующих белок и предотвращающих его инактивацию (рис. 13, III). Полученные результаты показывают, что включенный в полимерные наночастицы белок может быть защищен от факторов окружающей среды, протеолиза, а следовательно от опсонизации и выведения из организма.
4 3 Наночастицы с включенным тамоксифеном
Одним из важных свойств наносистем на основе амфифильных полимеров является их способность солюбилизировать - значительно увеличивать растворимость неполярных веществ в водных растворах. В результате солюбилизации образуются термодинамически устойчивые равновесные изотропные системы. В данной работе это было продемонстрировано на примере тамоксифена. Тамоксифен является синтетическим производным трифенилэтилена, обладает выраженными антиэстрогенными свойствами Высокий терапевтический потенциал данного лекарственного средства ограничен его плохой растворимостью в водной среде (менее 0,01 мг/мл). Нам удалось включить тамоксифен в наночастицы Dex10-PCL с высоким выходом, при этом максимальное содержание тамоксифена в наночастицах составило 77 % от массы частиц, а концентрация тамоксифена в воде увеличилась на два порядка. Изучение наночастиц с тамоксифеном методом динамического светорассеяния показало, что при включении тамоксифена наблюдается уменьшение радиуса частиц и удается получить монодисперсию наночастиц средним размером
200 ± 10 нм. С помощью 1Н-ЯМР спектроскопии показано, что увеличение PCL части молекулы для амфифильного Dex-PCL ведет к увеличению интенсивности пиков протонов, относящихся к тамоксифену, следовательно, тамоксифен лучше солюбилизируется в частицы с более выраженными гидрофобными свойствами.
Кинетику высвобождения тамоксифена из полимерных наночастиц на основе Бех10-РСЬ изучали в 0,05 М фосфатном буфере, содержащем 0,5% лаурилсульфата натрия (рис. 14). Высвобождение тамоксифена из наночастиц происходит постепенно и за 72 часа составляет 92%.
О 12 24 38 48 80 72 Время, ч
Рис. 14. Высвобождение тамоксифена из наночастиц Бехю-РСЬ в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,4; 37° С), содержащем 0,5% лаурилсульфата натрия.
В данной работе также удалось солюбилизировать тамоксифен и в ПВП-стеар наночастицы. Максимальный процент включения наблюдался для наночастиц, образованных ПВП-стеар с молекулярной массой 1500, и составлял 46 % от массы наночастиц. Методом динамического светорассеяния продемонстрировано, что включение тамоксифена приводит к незначительному уменьшению размера данных наночастиц, а также к снижению И.П.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наночастицы на основе ПВП-стеар и Бех-РСЬ можно успешно использовать для создания систем доставки различных БАВ.
5. Взаимодействие ПВП-стеар и Dex-PCL наночастиц с компонентами крови
Известно, что важным фактором при распределении полимерных частиц в организме является связывание ими белков сыворотки крови. Вопрос о характере воздействия плазменных белков на состояние клеток крови в присутствии различных БАВ и систем доставки практически не изучен и требует решения не только в теоретическом, но и в практическом аспекте. Поскольку свойства систем
доставки лекарственных препаратов главным образом определяются их взаимодействиями с различными компонентами крови, нами в первую очередь была проанализирована устойчивость наночастиц в сыворотке крови человека. Наночастицы из ПВП-стеар и Бех-РСЬ были стабильны в присутствии сыворотки крови человека.
Были проведены тесты по прямому литическому действию препаратов ПВП-стеар на эритроциты барана, сенсибилизированные антителами кролика (ЕА). Наночастицы ПВП-стеар 4500 и 5500 оказывают прямое литическое действие на сенсибилизированные эритроциты барана. Наночастицы на основе ПВП-стеар 3300 являются менее агрессивными по действию на ЕА, а состоящие из полимера ПВП-стеар с молекулярной массой 1500 не лизируют эритроциты барана Изучена активация системы комплемента в присутствии полимерных частиц Активацию системы комплемента как по классическому пути активации системы комплемента (КПК), так и по альтернативному пути (АПК) оценивали, во-первых, по величине lag-t, т.е. времени от момента внесения эритроцитов в исследуемую сыворотку до начала их лизиса. Эта величина характеризует скорость каскада реакций ограниченного протеолиза и формирования комплекса мембранной атаки. Вторая из исследованных величин - скорость лизиса (Уь). Она измеряется по уменьшению мутности взвеси эритроцитов и отражает «работу» комплекса мембранной атаки по лизису клеток. Как следует из данных, представленных в таблице 2, ни один из исследованных препаратов не оказывал существенного влияния на активацию комплемента по КПК и АПК.
Влияние ПВП-стеар на параметры активации системы комплемента
по альтернативному (АПК) и классическому (КПК) пути.
ПВП-стеар (5 мМ) АПК КПК ГЕК
ПВП-стеар 1500 87+9 85+22 98+5 99+5 100+5
ПВП-стеар 3300 95+19 94+7 98+5 97+5 100+5
ПВП-стеар 5500 91+5 102+13 98+5 90+7 100+5
Результаты представлены в % % к контролю (п=3),
Выявленное нами отсутствие воздействия наночастиц ПВП-стеар на величину гемолитической емкости комплемента (ГЕК) еще раз доказывает то, что исследованные препараты не инициируют каскады комплемента и не уменьшают литический потенциал системы. Этот факт можно рассматривать как одно из проявлений биосовместимости исследуемых препаратов. Отсутствие влияния наночастиц ПВП-стеар как на комплемент сыворотки крови, так и на мембрану эритроцитов барана в присутствии альбумина может свидетельствовать о сорбции альбумина и, возможно, других компонентов крови наночастицами.
Наночастицы Бех-РСЬ обладали литическим действим не только на сенсибилизированные эритроциты барана, но и кролика. В связи с этим не удалось изучить параметры активации системы комплемента в присутствии Бех-РСЬ наночастиц. Однако нами было показано, что для смешанных наночастиц Бех-РСЬ/ПВП-стеар наблюдалось снижение лизиса эритроцитов барана по сравнению с Бех-РСЬ наночастицами (рис. 15).
ПВП-стеар 3000 Dex10-PCL ОвхЮ-РСиПВП-
Рис. 15. Прямое литическое действие наночастиц на эритроциты барана.
Это еще раз доказывает возможность поверхностной модификации наночастиц, и на, наш взгляд, открывает новые возможности для создания лекарственных препаратов с новыми свойствами на основе уже используемых систем (создание гидрофильно-модифицированных «stealth» наночастиц).
Г. Разработаны методы получения наночастиц из амфифильных сополимеров Бех-РСЬ, ПВП-стеар и их смесей. Наиболее оптимальным способом получения наночастиц является эмульсионный метод.
2. Полученные наночастицы имели сферическую форму, размер всех частиц лежал в нанометровом диапазоне. Показана возможность варьирования важнейших физико-химических характеристик наночастиц, способных влиять на поведение исследуемых наносистем в организме.
3. Доказана структура наночастиц: 1) Бех-РСЬ наночастицы представляют собой устойчивые сферические образования с выраженной структурой «ядро-оболочка», где оболочкой являются цепи Бех; 2) наночастицы из ПВП-стеар являются агрегатами мицелл; 3) для смешанных наночастиц характерна поверхностная модификация частиц Бех-РСЬ цепями ПВП.
4. Получены и охарактеризованы Бех-РСЬ и ПВП-стеар наночастицы с высоким содержанием БАВ - тамоксифена и соевого ингибитора протеиназ типа Баумана-Бирк. Результаты свидетельствуют о том, что включенный белок защищен от инактивации. Показана возможность полного высвобождения БАВ из наночастиц в определенных условиях.
5. Исследование устойчивости наночастиц в сыворотке крови человека показало их высокую стабильность. Продемонстрировано, что влияние наночастиц из низкомолекулярных ПВП-стеар, как на комплемент сыворотки крови, так и на мембрану эритроцитов барана отсутствует. Показано снижение лизиса эритроцитов для смешанных наночастиц Бех-РСЬ/ПВП-стеар по сравнению с Бех-РСЬ наночастицами.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Ларионова Н.И., Балабушевич Н.Г., Виллемсон А.Л., Володькин Д.В., Балкина А.С. Создание систем доставки белков, обеспечивающих повышенную биодоступность. // III Московский международный конгресс: «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», Москва, 2005, с. 29.
2. Виллемсон АЛ, Кусков А.Н., Штильман М.И., Галебская Л.В., Рюмина Е.В., Ларионова Н.И. Взаимодействие полимерных агрегатов стеароил-лоли-К-винилпирролидона с компонентами крови. Биохимия, 2004, 69 (6), с. 765-773.
3. Villemson A.L., Couvreur P., Gref R., Larionova N.I. Micro- and nanoparticles from dextran-poly-8-caprolactone: preparation, structural characterization, enzymatic degradation and drug entrapment. // XII Int. BRG Workshop on Bioencapsulation, Vitoria, Spain, 2004, p. 65-68.
4. Ларионова Н.И., Балабушевич Н.Г., Виллемсон АЛ, Балкина А.С. Создание систем доставки ингибиторов протеиназ. // XI Научно-техническая конференция с участием зарубежных специалистов «Вакуумная наука», Судак, 2004, с. 223-227.
5. Villemson A.. Couvreur P., Lemarchand С, Larionova N., Gref R. Preparation, structural characterization and protein entrapment in dextran-coated micelles and nanoparticles. // European Conference on Drug Delivery and Pharmaceutical Technology, Sevilla, Spain, 2004, p. 117.
6. Villemson A.L.. Couvreur P., Gref R., Larionova N.I. Biodegradable dextran-poly-E-caprolactone micro- and nanoparticles for tumor targeted delivery of tamoxifen. // The 4th international postgraduate research symposium on pharmaceutics, Istanbul, Turkey, 2004, p. 15.
7. Виллемсон А.Л., Малых Е.В., Штильман М.И., Ларионова Н.И. Самоорганизующиеся системы на основе амфифильного поливинилпирролидона и их взаимодействие с модельными белками. Биохимия, 2003, 68 (8), с. 1063-1069.
8. Виллемсон А.Л., Греф Р., Куврер П., Ларионова Н.И., Наночастицы из декстран-поликапролактона: получение и структурная характеристика. // Инженерная энзимология. Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов фонда И.В. Березина, Москва, 2003, с. 10.
9. Villemson A.. Shtilman M., Larionova N. A novel drug delivery system based on amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone and its interaction with the blood components. // 1st EUFEPS Conference on "Optimising Drug Delivery and Formulation" New Challenges in Drug Delivery, 2003, Paris/Versailles, France
10.Виллемсон А.Л. Взаимодействие полимерных агрегатов стеароил-поли-N-винилпирролидона с компонентами крови. // Ломоносов-2003, Москва, 2003, с. 107.
11.Виллемсон А.Л., Кусков А.Н., Ларионова Н.И., Штильман М.И. Влияние молекулярной массы на самоорганизацию амфифильных производных поли-N-винилпирролидона. Успехи в химии и химической технологии, 2002, 3(20), с. 57.
12.Villemson A.L. Self-assembling amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone for development of protein delivery system. // The 3th international postgraduate research symposium on pharmaceutics, Istanbul, Turkey, 2002, p. 25.
13.Villemson A.L. Malykh E.V., Shtilman M.I., Larionova N.I. Self-assembling systems based on amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone as carriers for proteins // Biocatalysis-2002 (Биокатализ-2002), Moscow, 2002, p. 116.
14.Виллемсон А. Л, Малых Е.В., Ларионова Н.И., Штильман М.И. Взаимодействие амфифильного поли^-винилпирролидона с соевым ингибитором протеиназ типа Баумана-Бирк и его гидрофобизованными производными. // V Симпозиум. Химия протеолитических ферментов, Москва, 2002, с. 120.
15.Malykh E.V., Villemson A.L., Charipova E.I., Shtilman M.I., Larionova N.I. Interaction of stearoyl-poly-N-vinylpyrrolidone with native and dioleoyl soybean Bowman-Birk protease inhibitors. // The Symposium of 13th Microencapsulation,, Angers, France, 2001, p. 40.
16.Штильман М.И., Ларионова Н.И., Шарипова Е.И., Малых Е.В., Кусков А.Н. Виллемсон А.Л.. Амфифильные производные поли^-винилпирролидона. Поведение в растворах. // Международная конференция молодых ученых: От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок: экологически безопасные технологии. Тверь, 2001, с. 44.
17.Виллемсон А.Л. Полимерные системы на основе поли N-винилпирролидона //Ломоносов-2001, Москва, 2001, с. 132.
18.Villemson A.L., Malykh E.V., Charipova E.I., Shtilman M.I., Larionova N.I. Amphiphilic derivatives ofpoly-N-vinylpirrolidone. // Technologii Organicznej I Tworziyw Sztucznych Politechniki Wroclawskiej. Seria: Konferencje, Prace Naukowe Institutu, Prace, 2001, p. 23.
Принято к исполнению 18/04/2005 Заказ № 768
Исполнено 19/04/2005 Тираж 100 экз
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 www autoreferat ru