научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ГИБРИДНЫХ СТРУКТУР НА ОСНОВЕ ФУЛЛЕРЕНА С60 Биология

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ГИБРИДНЫХ СТРУКТУР НА ОСНОВЕ ФУЛЛЕРЕНА С60»

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ГИБРИДНЫХ СТРУКТУР НА ОСНОВЕ ФУЛЛЕРЕНА С60

© 2011 г. В. В. Григорьев*, Л. Н. Петрова*, Т. А. Иванова*, Р. А. Котельникова**, Г. Н. Богданов**, Д. А. Полетаева**, И. И. Файнгольд**, Д. В. Мищенко**, В. С. Романова***, А. И. Котельников**, С. О. Бачурин*

*Институт физиологически активных веществ РАН, 142432 Московская обл., Черноголовка, Северный пр., 1 **Институт проблем химической физики РАН, 142432 Московская обл., Черноголовка, просп. Академика Семенова, 1 ***Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 28

E-mail: kotel@icp.ac.ru Поступила в редакцию 22.12.2009 г.

Изучено нейропротекторное действие гибридных структур на основе базового соединения: фулле-рена С60 с присоединенной к нему аминокислотой пролином. Гибридные структуры содержали природный антиоксидант карнозин или адденды с одной или двумя нитратными группировками. Показано, что все соединения обладают антиоксидантной активностью, уменьшая концентрацию малонового диальдегида в гомогенатах головного мозга крыс. Наиболее эффективным антиокси-дантом оказалось соединение I, в структуру которого был включен антиоксидант карнозин. Все соединения кроме IV и V ингибируют активность моноаминооксидазы В, при этом соединения I—IV повышают активность моноаминооксидазы А. Все исследованные соединения ингибируют глута-мат-индуцированный захват Са2+ в синаптосомы коры мозга крыс. Наиболее эффективным ингибитором является соединение III, в состав которого включены две нитратные группировки. Это же соединение вызывает достоверное увеличение токов АМРА-рецепторов.

Известно, что фуллерены обладают уникальной пространственной и электронной структурой, обуславливающей выраженные донорно-акцептор-ные и фотофизические свойства. При варьировании аддендов, присоединяемых к фуллереновому сфероиду, производные фуллерена С60 приобретают амфифильные и стереоспецифичные мем-бранотропные свойства, а также способность проявлять антиоксидантную и противовирусную активность (Krustic et al., 1991; Kotelnikova et al., 1996; Богданов и др., 2004). В ряде работ показано, что фуллерен С60 и некоторые его производные ингибируют холинэстеразу (Pastorin et al., 2006) и процесс агрегации ß-амилоидных белков (Lin et al., 2002), предупреждают гибель нейронов (Kim, Lee, 2003), оказывают выраженное стимулирующее действие на центральные дофаминовые рецепторы, а также предотвращают нарушение долговременной памяти (Dugan et al., 1997). Благодаря этим свойствам фуллерен С60, с одной стороны, рассматривается в химической фармакологии как носитель функциональных группировок, обладающих биологической активностью, а с другой — сам обладает биологической, в частности, нейропротекторной, активностью (Podols-ki et al., 2007). Вследствие этого представляется перспективным создание гибридных нанострук-

тур на основе фуллерена С60 (ГСФ) для терапии нейродегенеративных заболеваний. Такие наноструктуры являются продуктами присоединения к сфероиду фуллерена двух аддендов, одним из которых является аминокислота, обеспечивающая растворимость наноструктур в воде, а другим — биологически активная группировка, проявляющая антиоксидантное или NO-донорное действие (Котельников и др., 2008).

В настоящее время основными критериями при скрининге потенциальных препаратов для лечения нейродегенеративных нарушений, кроме ингибирования агрегации ß-амилоидных белков, являются антиоксидантная активность и ингиби-рующее действие на каталитическую активность митохондриального фермента окислительного дезаминирования биогенных аминов — моноаминооксидазы В (МАО-В) (Melchior, Collins, 1982; Krustic et al., 1991). Пероксидное окисление ли-пидов (ПОЛ) при болезни Альцгеймера является одним из важнейших процессов, сопровождающих заболевание. Установлена взаимосвязь между снижением содержания митохондриальной су-пероксиддисмутазы (Cu, Zn-СОД) и интенсификацией процесса генерации супероксидов при болезни Альцгеймера (Lin et al., 2002). Роль СОД в этом процессе объясняется ее основной функ-

цией — инактивацией супероксидных анион-радикалов. Свойства производных фуллеренов позволяют предположить, что они могут проявлять нейропротекторное действие.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГСФ были синтезированы по методикам, описанным в работах Романовой с соавт. (1994) и Ко-тельникова с соавт. (2008).

Определение интенсивности ПОЛ мембран. Интенсивность ПОЛ в гомогенате коры головного мозга крыс оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) в 1 г ткани (Артюхов, На-квасина, 2000).

Для оценки влияния ГСФ на ПОЛ гомогената коры головного мозга крыс к 2.25 мл гомогената в К, №-фосфатном буфере (рН 7.4) добавляли 0.25 мл ГСФ в концентрации 10-4 М (в том же буфере) для получения конечной концентрации соединения в пробе 10-5 М и инкубировали 30 мин при 37°С. К полученному образцу добавляли 1 мл 17%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и центрифугировали 10 мин при 3000 §. К пробам (2 мл супер-натанта) добавляли 1 мл 0.8%-ной тиобарбитуровой кислоты, инкубировали в водяной бане 30 мин при 100°С, затем охлаждали до комнатной температуры и регистрировали оптическую плотность при длине волны 532 нм.

Концентрацию МДА рассчитывали по формуле:

где К — концентрация МДА; А0 — оптическая плотность опытного образца; А1с — оптическая плотность буферного раствора; 6 — молярный коэффициент экстинкции, равный 1.56 х 105 М-1 см-1.

Полученное значение делили на массу ткани (кора головного мозга крыс), из которой готовили гомогенат.

Определение активности моноаминооксидазы А (МАО-А) и МАО-В. Ферментативную активность МАО-А и МАО-В в суспензии митохондрий го-могената коры мозга крыс определяли по методике, описанной в работе Веревкиной с соавт. (\fery-оукта et al, 1972). Метод основан на спектрофлуо-риметрическом определении количества аммиака, выделяющегося в результате ферментативной реакции дезаминирования биогенных аминов серо-тонина и бензиламина мембраносвязанными ферментами МАО-А и МАО-В. В пробу суспензии митохондрий, содержащую 5 мг белка, добавляли субстрат в конечной концентрации 10-3 М, 0.2 мл исследуемых соединений в концентрации

5 х 10-5 М (конечная концентрация в пробе 10-5 М) и доводили объем 0.1 М К, Na-фосфатным буфером (рН 7.4) до 1 мл. Пробы инкубировали при 37°С в течение 1 ч, реакцию субстратного взаимодействия останавливали добавлением 0.1 мл 50%-ной ТХУ и центрифугировали при 4500 g 20 мин. Су-пернатант помещали в пробирки, для подщела-чивания среды добавляли по 2 мл насыщенного раствора К2СО3, закрывали притертой пробкой со стеклянной палочкой внутри, на конце которой находилась капля 1 N серной кислоты, и выдерживали при комнатной температуре. Через 12 ч палочки с капельками, содержащими сульфат аммония (выделившийся в результате реакции нейтрализации), помещали в 4.5 мл дистиллированной воды. В пробирки добавляли по 0.5 мл реактива Несслера и через 30 мин регистрировали оптическую плотность растворов на спектрофотометре "Sperard М40" (Германия) при X = 430 нм. По калибровочному графику определяли концентрацию выделившегося аммиака. Полученное значение соответствует активности фермента. Для определения удельной активности это значение делили на количество белка в образце. Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al, 1951).

Влияние ГСФ на глутамат-индуцированный захват 45Са2+ в синаптосомы коры мозга крыс. Для изучения влияния производных фуллерена С60 на пресинаптические глутаматные рецепторы использован радиометрический метод определения захвата 45Са2+ в синаптосомы коры мозга крыс при стимуляции глутаматом. Глутаминовая кислота активирует все подтипы глутаматных рецепторов, которые присутствуют в Р2-фракции си-наптосом (фракция неочищенных синаптосом: митохондриально-синаптосомальная фракция) коры мозга крыс: ионотропные NMDA (N-ме-тил-Э-аспартат), каинатные, а также метабо-тропные рецепторы I типа (Петрова, Бачурин, 2006). Р2-фракцию синаптосом выделяли по стандартной методике Хайоша (Hajos, 1975) из коры мозга новорожденных крыс (9—10 сут) породы Вистар. Ткань гомогенизировали в 10 объемах охлажденной (4°С) 0.32 М сахарозы при скорости 900 об./мин в гомогенизаторе марки МR (Германия). Гомогенат центрифугировали 10 мин при 1500 g. Супернатант центрифугировали 20 мин при 10000 g. Для аккумуляции радиоактивной метки осадок, содержащий Р2-фракцию синапто-сом, суспендировали в инкубационном буфере А: 132 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 5 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы, pH 7.4 (конечная концентрация белка во фракции 1.5—2 мг/мл). В полученную суспензию добавляли радиоактивную метку (45Са2+).

Концентрация метки в конечном объеме суспендированной фракции составляла 1.25 мМ (1.4 мкКи/мл). Для стимуляции захвата 45Са2+ в синаптосомы использовали глутамат в конечной концентрации 200 мкМ. После 5 мин инкубации образцов с глутаматом при 37°С (50 мкл Рефракции, 20 мкл глутамата, конечный объем образцов доводили буфером до 1 мл) пробы пропускали через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman, Великобритания), промывая три раза холодным (4°С) буфером Б: 145 мМ HEPES, 10 мМ три-са, 5.4 мМ трилона Б; pH 7.4. Все опыты ставили в 3 параллельных пробах в 2 независимых экспериментах. Пробы анализировали с помощью жидкостного сцинтилляционного бета-анализатора (TriCarb, Perkin Elmer, США). Количество захваченного в синаптосомы 45Са2+ определяли по разнице в содержании метки при стимуляции захвата глутаматом и без стимуляции и выражали его в процентном отношении от контроля.

Специфический захват 45Са2+ (К) определяли по формуле:

К = [(Са4 - Са3)/(Са2 - Са1)] х 100%,

где Са1 — захват 45Са2+ в контроле (без глутамата и тестируемого соединения), Са2 — захват 45Са2+ при стимуляции глутаматом, Са3 — захват 45Са2+ в присутствии тестируемого соединения (без глутамата), Са4 — захват 45Са2+ в присутствии глутамата и тестируемого соединения.

Соединения I, II исследовались в диапазоне концентраций 10-9—10-4 М, соединение III — в диапазоне концентраций 10—10—10 4 М.

Статистическую обработку результатов проводили по

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.