РОЛЬ АССОЦИАЦИИ ПРОСТЕЙШИХ TETRAHYMENA PYRIFORMIS И БАКТЕРИЙ BURKHOLDERIA CEPACIA В ФОРМИРОВАНИИ БИОПЛЕНОК

1 УДК : РОЛЬ АССОЦИАЦИИ ПРОСТЕЙШИХ TETRAHYMENA PYRIFORMIS И БАКТЕРИЙ BURKHOLDERIA CEPACIA В ФОРМИРОВАНИИ БИОПЛЕНОК А.А. Каминская, В.И. Пушкарева, С.А. Ермолаева, Т.В. Степанова, Н.В. Алексеева, А.Л. Андреев Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва Почвенные и водные биоценозы включают популяции прокариотических и эукариотических организмов, функционирующих как единое целое, с многообразными и неоднозначными связями. С 80-х годов XX века внимание исследователей привлекло явление, давно известное в микробиологии как «фиксированная» форма существования бактерий, в том числе и патогенных, как на неживых субстратах, так и в различных ассоциациях: с водорослями, ризосферой растений, простейшими, ракообразными и другими организмами [2, 6, 11, 13,

2 2 24]. В англоязычной литературе этот феномен стал описываться как «биопленки». Сканирующая лазерная микроскопия позволила наблюдать за развитием биопленочных сообществ, прикрепленных к субстратам естественного и искусственного происхождения [14, 15]. Изучение экологических аспектов формирования биопленок дает возможность выявить роль абиотических (состав сред, температура, ph) и биотических (простейшие) факторов в реализации данной стратегии существования микроорганизмов в природе, что особенно важно для возбудителей сапронозных инфекций, способных обитать в почвах и водоемах [3-5, 8]. В первом ряду оказались весьма значимые для инфекционной патологии микроорганизмы - легионеллы, псевдомонады и холерные вибрионы, однако и другие бактерии - кампилобактеры, клебсиеллы, сальмонеллы, листерии - также привлекли внимание исследователей способностью формировать биопленки [12, 18, 20, 22, 23, 25-27]. Burkholderia cepacia и близкородственные им Pseudomonas aeruginosae являются патогенными для человека, вызывая многочисленные случаи инфекций у иммунокомпрометированных больных, а также у пациентов, при лечении которых использовали имплантаты: искусственные клапаны сердца, линзы и другие эндопротезы. Установлено, что бактерии способны колонизировать

3 3 поверхности этих материалов, образуя биопленки [15-17]. В природных экосистемах участие B.cepacia в формировании биопленок неизвестно. Доказано, что B.cepacia имеют тесные биоценотические связи с почвенными и водными простейшими (амебами, инфузориями) основными природными хозяевами многих потенциально патогенных бактерий [7-10, 19, 21]. Не исключено, что свободноживущие простейшие в биопленочных сообществах могут занимать особый функциональный статус, однако эта их экологическая ниша пока остается неизвестной. Цель данной работы - изучение способности инфузорий Tetrahymena pyriformis в ассоциации с Burkholderia cepacia различных штаммов формировать биопленки в искусственной среде и модельной, приближенной к естественной. Материалы и методы В экспериментах использована группа изогенных штаммов B.cepacia, различающихся по способности формировать биопленки: исходный штамм B.cepacia 370, геномовар IIIa типа с умеренной способностью формировать биопленки, а также его мутанты, полученные методом инсерционного мутагенеза [26]:

4 4 Bf++ с повышенной способностью формирования биопленки; Bf- дефектный по способности формировать биопленки. Бактериальные культуры выращивали в агаризованной среде Luria-Bertani (LB) при 28 0 C; мутанты - c добавлением канамицина 100 мкг/мл и ампициллина100 мкг/мл. Биохимическую активность штаммов B.cepacia проводили на тест-системах API 20 NE (BIO - Merieux, France) и в ПЦР, которую ставили с парой праймеров Eub 16-1 (5' - AGGGTTGGATTCTGGCTCAG - 3') и CeMu Vi 16-2 (5' - CCGACTGTATTAGAGCCA - 3') для выявления последовательности 16S и 23S рибосомальной РНК длиной 463 п.н. Аксеническую культуру инфузорий Tetrahymena pyriformis (штамм GL из коллекции НИИЭМ им. Гамалеи) культивировали, как описано ранее [7]. Совместное культивирование буркхолдерий и простейших (микробная нагрузка 100 м.к. на 1 особь) проводили при 28 0 С в различных средах: в LВ-бульоне; в смешанной среде - LВ+почвенная вытяжка (в соотношении 1:1);

5 5 в водной почвенной вытяжке (иловато-болотная почва Приокского заповедника). Для контроля служили те же среды, содержащие B.cepacia соответствующих штаммов (без инфузорий), а также аксеническая культура простейших. Биопленки получали в плоскодонных пластиковых планшетах для иммуноферментного анализа емкостью 3 мл. Для этого ночные культуры исследуемых штаммов разводили в соответствующей для каждого эксперимента свежей среде до концентрации 10 7 м.к./мл. Полученные суспензии стерильно вносили по 1,2 мл в лунки планшета (6 лунок для каждого штамма), затем в эти же лунки добавляли культуру T.pyriformis (10 5 ос/мл) в том же объеме. В контрольные лунки вносили раздельно культуры бактерий и инфузорий. Планшету помещали в термостат при 28 0 С, и образцы исследовали в динамике - от 24 до 72 часов. Оптическую плотность планктонной субпопуляции бактерий определяли на фотометре iems Reader MF «Labsystems» (Швеция) при длине волны 540 нм. В определенном интервале времени содержимое всех лунок осторожно отсасывали и заполняли 2,4 мл дистиллированной воды с 250 мкл 1% спиртового раствора кристалл-виолета. Лунки, заполненные красителем, инкубировали

6 6 при комнатной температуре в течение 45 мин., затем краситель отсасывали, и лунки троекратно промывали дистиллированной водой. В отмытые от несвязавшейся краски лунки вносили по 3 мл этилового спирта и оставляли на 45 мин. при комнатной температуре. Полученный раствор в 4-кратной повторности переносили в лунки иммунологической планшеты меньшей емкости 300 мкл. Количество сформировавшейся биопленки оценивали по интенсивности окрашивания спирта, что отражалось показателями фотометрии. Фоновые показатели регистрировали в лунках, содержащих «чистые» питательные среды и культуру простейших. Опыты повторяли трижды. Количество планктонных бактерий регистрировали фотометрически и бактериологически, а инфузорий микроскопией в камере Горяева (микроскоп Amplival, увеличение х20). Статистическую обработку осуществляли по программе Exсel 2000 (Microsoft Inc., 1999), Statistica for Windows v 5.0 (Statsoft Inc., 1995). Результаты Клетки B.cepacia исходного штамма и производных мутантов по культуральным, морфологическим, биохимическим,

7 7 цитопатогенным свойствам и способности к пигментообразованию не различались. Использование трех сред культивирования искусственной, оптимальной для формирования биопленки (LB-бульон), смешанной (LB+почвенная вытяжка) и приближенной к естественной (почвенная вытяжка) диктовалось необходимостью оптимизировать популяции буркхолдерий и тетрахимен к условиям одновременного существования и вместе с тем не только визуально оценивать формирование биопленок, но и проводить количественный учет их биомассы. Все пробы инкубировали при 28 0 С температуре, являющейся верхним пределом оптимума для инфузорий и наиболее благоприятной для размножения буркхолдерий. Качественная оценка сформировавшихся биопленок. Были получены биопленки в разных культуральных средах, через сутки весьма слабые в отсутствие простейших и более заметные в ассоциации. При визуальной оценке через двое суток в большинстве лунок отмечали наличие сформировавшихся (зрелых) биопленок, причем простейшие явно стимулировали этот процесс. В LBбульоне накопление биомассы было наибольшим, в смеси бульона с почвенной вытяжкой умеренным и в почвенной вытяжке наименее выраженным. При этом буркхолдерии всех исследуемых штаммов, в

8 8 том числе и мутанта, дефектного по способности формировать биопленки в сообществе с простейшими, вели себя сходным образом и образовывали более интенсивную биопленку (табл.). Известно, что популяции бактерий и простейших, участвующих в процессе формирования биопленок, состоят из свободно плавающих (планктонных) особей и фиксированных в экзополисахаридном матриксе форм [22, 23]. В ходе экспериментов оценивали динамику численности планктонных субпопуляций бактерий и инфузорий. При культивировании в LB-бульоне и смеси LB+почвенная вытяжка буркхолдерии всех испытанных штаммов в первые часы взаимодействия с инфузориями активно фагоцитировались последними, что подтверждалось микроскопически, однако темпы размножения в богатых питательных средах были достаточно высоки, чтобы компенсировать хищническое поглощение бактерий инфузориями. Бактериологические исследования выявили концентрации, близкие к исходным (10 7 КОЕ/мл). Через сутки наблюдали неуклонное увеличение численности бактерий до конца опыта (рис. 1А). В контрольных образцах (без простейших) планктонные субпопуляции буркхолдерий всех испытанных штаммов размножались с одинаковой скоростью, достигая максимальной

9 9 концентрации КОЕ/мл, что соответствует оптической плотности 0,7-1,0 (рис. 1Б). Планктонные субпопуляции инфузорий в ассоциации с бактериями исходного штамма и мутанта Bf++ снижали свою численность в течение 72 часов до 10 3 ос/мл, причем по мере созревания биопленок многие особи имели явные признаки деструкции, вплоть до разрыва клеток. Напротив, при взаимодействии с мутантом Bf- (дефектным по способности формировать биопленки) тетрахимены бурно размножались, достигая максимальной концентрации 2x10 5 ос/мл. Иным образом вели себя планктонные субпопуляции бактерий и простейших при культивировании в почвенной вытяжке. В ассоциациях буркхолдерии всех штаммов утилизировались инфузориями с невысокой интенсивностью, а темпы размножения позволяли бактериям сохранить численность на невысоком уровне. Инфузории в почвенной вытяжке не испытывали цитопатогенного воздействия со стороны буркхолдерий: в планктонных субпопуляциях они находились в вегетативной форме, подвижны, без морфологических изменений, причем размножались с такой же скоростью как и в аксенической культуре. Фотометрия интенсивности формирования биопленок выявила следующее. В LB-бульоне мутант, обладающий наибольшей

10 10 способностью к образованию биопленок (Bf++), демонстрировал максимальное накопление биомассы как в отсутствие простейших, так и, особенно, в ассоциации с ними (рис. 2). Клетки буркхолдерий исходного штамма в ассоциации с инфузориями также весьма интенсивно формировали биопленку. В то же время мутант Bf-, который без простейших не проявлял активности, в ассоциации с инфузориями формировал биопленку, хотя и весьма слабую (рис. 2). В менее богатой среде (LB+почвенная вытяжка), а также в почвенной вытяжке эта закономерность сохранялась, однако количество биопленок было значительно ниже. Мутант Bf- в отсутствие инфузорий ни в одной испытанной среде не формировал биопленку (табл.). Световая микроскопия препаратов из биопленок (нативных и окрашенных по Романовскому-Гимзе) выявила структуры экзополисахаридного матрикса, в которых находились неподвижные округлившиеся клетки инфузорий, не перешедшие, однако, в цистную форму. Обсуждение Наше внимание было сфокусировано на абиотических (состав культуральных сред, температура) и биотических факторах (простейшие) среды, контролирующих процесс формирования

11 11 биопленок в модельных водных экосистемах. Качественный анализ образцов позволил визуально оценить, при каких условиях происходит наибольшее накопление пленочной биомассы. B.cepacia 370 исходного штамма и его мутанты с разной способностью формировать биопленки, в оптимальных температурных условиях (при 28 0 С) и богатых средах (LB-бульоне и его смеси с почвенной вытяжкой) через 2 суток на поверхности и стенках лунок образовывали тонкие пленки. В почвенной вытяжке они были едва заметны. Мутант, дефектный по формированию биопленок, ни в одной среде не проявлял этого признака. Картина кардинально менялась, когда к бактериальным популяциям подселяли инфузорий. Уже через двое суток во всех лунках, как с искусственной средой, так и с почвенной вытяжкой, наблюдали интенсивное накопление биопленок. Даже мутант, сам по себе не формировавший биопленки, проявлял это свойство (табл.). Максимальная биомасса накапливалась через 3-4 суток инкубации. Характерно, что такие сроки накопления биопленок отмечены для легионелл, псевдомонад и вибрионов [13, 14, 22, 23]. При количественной оценке наибольшее накопление биопленки выявлено при взаимодействии мутанта Bf++ с инфузориями в LB бульоне; буркхолдерии остальных штаммов в сообществе с простейшими также обладали выраженной

12 12 способностью к формированию биопленки (рис. 2). В почвенной вытяжке все они также проявляли это свойство, хотя биопленок было значительно меньше. Интересно отметить двоякую роль простейших при взаимодействии с буркхолдериями в процессе формирования биопленок. С одной стороны, они выполняют функцию хищников, утилизирующих часть планктонной субпопуляции бактерий, что соответствует результатам, полученным для синегнойной палочки и холерных вибрионов в сообществе с морскими жгутиконосцами (Flagellatae) - другими хищными простейшими [22, 23]. С другой стороны, в ходе этого процесса селектируются устойчивые к перевариванию бактериальные клетки, размножение которых переводит межпопуляционные взаимодействия в русло «паразито хозяинных», как это детально расшифровано у ряда патогенных бактерий, включая и B.cepacia [7]. Сформировавшиеся биопленки способствуют распространению и устойчивому существованию возбудителей в природных экосистемах [23]. Сами инфузории (по-видимому, их планктонная субпопуляция) стимулировали процесс формирования биопленок во всех вариантах опытов, причем продукция биомассы нарастала линейно в течение 3-4 суток. Проверка возможности утилизации

13 13 простейшими самих биопленок (данные не приводятся) показала, что этого не происходит. Надо полагать, что сложные микроскопические методы, в частности с использованием сканирующего лазерного конфокального микроскопа, позволят вскрыть более тонкие структуры экзополисахаридного матрикса, сформированные протозойно-бактериальным сообществом. Учитывая полученные результаты, можно предположить, что простейшие заметно способствуют существованию бактериальной популяции в составе биопленок. Своеобразие данной экологической ниши патогенных бактерий позволяет считать формирование биопленок с участием простейших, а возможно, и других сочленов биоценоза, одним из механизмов устойчивого существования возбудителей сапронозов в почвах и водоемах. Исследование поддержано РФФИ, проекты а,

14 14 Таблица. Способность разных штаммов Burkholderia cepacia к формированию биопленок в ассоциации с простейшими и в их отсутствие Варианты опытов, штаммы Эффект (в LB) Эффект (в LB/ПВ) Эффект (в ПВ) 1. T.pyriformis+B.cepacia 370 (исходный) /+ 2. B.cepacia 370 (исходный) ++ ++/ T.pyriformis с мутантом Bf /+ 4. Bf / T.pyriformis с мутантом Bf ++ ++/ Bf Примечание: LB бульон; LB/ПВ почвенная вытяжка; ПВ почвенная вытяжка

15 15 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. // Генетика (11). С Куликовский А.В., Павлова И.Б., Айвазян М.А., Дроздова Т.Д. // Вестник с.-х. науки С Литвин В.Ю. // Экология возбудителей сапронозов. Москва С Литвин В.Ю. // Потенциально патогенные бактерии в природе. Москва С Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М., Боев Б.В. // Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: Фармарус принт, с. 6. Мидоуз П. // IХ Междун. конгресс по микробиологии. Москва С Пушкарева В.И., Константинова Н.Д., Литвин В.Ю. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол С Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах // Дисс. докт. биол. наук. Москва Пушкарева В.И., Величко В.В., Каминская А.А., Литвин В.Ю. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол С. 39.

16 Пушкарева В.И. // Успехи соврем. биологии Т.. 4. С. 11. Сукачев В.Н. Основы теории биогеоценологии. М. АН СССР с. 12. Boyd A., Chakrabarty A.M. // J. Ind. Microbiol V. 15. P Costerton J.W., Geesy G.G., Cheng K.-J. // Ann. Rev. Microbiol V. 41. P Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E. et. al. // Microbiol. biofilms. Ibid V. 49. P Donlan R.M., Costerton J.W. // Clin. Microbiol. Rev V. 15. P Gauthier Y., Isoard P. et. al. // Ind. alim et agr V N 1-2. P Girardeau J.P. // 6 eme Reun. Microbial. INRA. Murat-le- Quaire. Versailles P Keevil C.W. // Water Sci. Thechnol V. 47 (5). P Landers P., Kerr K.G., Rowbotham T.J. et. al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis V. 19. P Mampel J., Spirig T., Weber S.S. et. al. // Appl. Environ. Microbiol V. 72 (4). P

17 MaroldaC.L., Hauroder B., John M.A. et. al. // Microbiology V P Matz C., Bergfeld T., Rice S.A. et. al. // Environment. Microbiol V. 6 (3). P Matz C., McDougald D., Moreno A.M. et. al. // PNAS V P Pedersen K. // Eppl. Environ. Microbiol V. 44. P Stepanovic S., Cirkovic I., Ranin L. et. al. // Lett Appl Microbiol V. 38. P Watnick P., Kolter R. // Mol. Microbiol V. 34(3). P Weitere M., Bergfeld T., Rice S.A. et. al. // Environ. Microbiol V. 7 (10). P

18 18 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 А ,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Б Рис. 1.