Доступная микрофото- и микровидеосъёмка.

Световая микроскопия — один из основных методов биологического исследования на протяжении уже более трёх веков. С её помощью проводятся диагностические, микробиологические, цитологические, гистологические и многие другие исследования. Кто придумал микроскоп сейчас сказать сложно. В учебниках биологии изобретение микроскопа обычно приписывают Левенгуку, хотя это ни в коем случае не соответствует действительности, как и то, что Колумб якобы открыл Америку, Левенгук лишь начал активное применение микроскопов в биологии (а точнее в зоологии) во второй половине 17 века. На самом деле, дошедшие до нас первые сведения о микроскопах относятся к концу 16 века (1590 г.), и связаны с такими именами, как Иоанн Липперсгей и Захарий Янсен, позже, в начале 17 века, микроскоп делает Галилео Галилей (который он назвал «оккиолино»). Я не удивлюсь, если вдруг найдут какой-нибудь древний микроскоп где-нибудь на раскопках шумерской цивилизации или какие-либо упоминание о микроскопах в древних санскритских источниках. Первоначально световой микроскоп представлял собой комбинацию двух линз — объектива и окуляра. Позже стали применять конденсоры и зеркала для улучшения освящения, составные объективы и окуляры для усиления увеличения и улучшения качества изображения, призмы и зеркала для удобства наблюдателя. Применялись различные приёмы освящения, и прочие приёмы, позволяющие наблюдать или направленные на улучшение наблюдения тех или иных объектов или структур. Но фактически, микроскоп оставался чисто оптическим прибором, в котором регистрирующим устройством являлся человеческий глаз. В 20 веке человеческий глаз стал заменяться фотопластинкой или фотоплёнкой. Так зародилась микрофотография — получение фотоснимков микроскопических объектов. Это стало весьма полезным для работы исследователей самых различных областей науки. Ведь любому исследователю рано или поздно приходится поделится своими достижениями с другими людьми, оставить что-то своим потомкам. А как передать сведения потомкам о том, что исследователь видел в микроскопе? Описать словами? Это сложно, к тому же накладывает субъективные отпечатки и автора и читателя. Зарисовать? Зачастую многие так и делали, поэтому в былые времена любой натуралист должен быть по совместительству ещё и художником, видимо по этой давней традиции кое-где студентов всё ещё заставляют рисовать в альбомах то, что они видят в микроскопе, но к сожалению не все гениальные учёные являлись столь же гениальными художниками, к тому же опять же накладывает субъективный фактор художника. А микрофотография разом решает эту проблему. Поместив микрофотографию в книгу или научную статью, автор мог передать читателю именно то, что видел в микроскопе. В конце 20, и начале 21 века цифровая фотография вытеснила плёночную. Аналогичную картину можно увидеть и в микрофотографии. В результате на рынке появились два вида товаров: «компьютерные микроскопы» - приборы, изначально предназначенные для работы с компьютером и «видеонасадки» небольшие устройства, устанавливаемые на обычные микроскопы вместо окуляров. Хорошие компьютерные микросковы обладают большими возможностями (например, картируемый предметный столик), но очень дорого стоят. Видеонасадки стоят на порядок дороже своей реальной себестоимости, к тому же далеко не всегда отвечают требованиям исследователя. Производители видеонасадок видимо считают, что могут запросить с исследователя столько денег, сколько захотят, всё равно она стоит дешевле компьютерных микроскопов. Есть ли способ получать микрофотографии и микровидеосъёмку без серьёзных капиталовложений? Есть! И я Вам это сейчас докажу!

Теория вопроса

Как говорилось ранее, классический микроскоп состоит из двух линз объектива и окуляра. Объектив — выпуклая собирающая линза или в настоящее время чаще комплекс линз, которая формирует действительность изображение исследуемого объекта в тубусе за объективом. Тубус — дословно труба, в микроскопе — канал или пространство для хода световых лучей, изолирующий их от постороннего света. Окуляр — собирающая линза или комплекс линз, служащая для восприятия изображения человеческим глазом, и дающая дополнительное увеличение. Окуляр образует с оптической системой глаза единый комплекс собирающих линз, в результате чего формирует мнимое изображение объекта. Оптическая схема классического микроскопа. На схеме показана главная оптическая ось, ход лучей от источника света через конденсор, предметное стекло с препаратом, далее через объектив, тубус и окуляр микроскопа, далее через оптическую систему глаза, и заканчивается отображением объекта на сетчатке глаза. В классический микрофотографии вместо сетчатки глаза используется фотопластинка или фотоплёнка. А окуляр вместе с оптической системой глаза заменяет так называемый фотоокуляр. В видеонасадке принцип примерно тот же. Видеонасадка рассчитана на то, чтобы стоять на месте окуляра. В видеонасадке вместо фотоплёнки используется светочувствительная ПЗС-матрица. Точно такие же ПЗС-матрицы, используются в современных видеокамерах, цифровых фотоаппаратах, телекамерах, камерах видеонаблюдения, веб-камерах, и тому подобных устройствах, работающих с захватом каких-либо изображений. Но тут есть один нюанс, связанный с использованием ПЗС-матриц, вместо фотоплёнки, и тем более вместо человеческого глаза. Дело в том что вторая, располагаемая после тубуса линза или система линз, в случае с человеческим глазом (окуляр) служила для совместимости прибора с человеческим глазом и для дополнительного увеличения, в случае с фотоплёнкой — просто для дополнительного увеличения. Но в случае с ПЗС-матрицой она абсолютно не нужна. Так как размеры ПЗС-матриц меньше размера фотокадра, никакое дополнительное увеличение не требуется! Мы просто напрямую можем использовать действительное изображение объекта, формирующееся за объективом. Схематически это выглядит так: Действительное изображение объекта отображается на фоточувствительной матрице увеличено, по тому же принципу, как раньше увеличено отображались на экране слайды, вставленные в диапроектор. Как известно, чем меньше компонентов использовано в оптической системе, тем меньше вероятность появления различных искажений и артефактов. Кстати, это одна из причин, по которой подобную схему использовать выгоднее, чем пользоваться штатной видеонасадкой. Именно по такой схеме мы будем строить наш «компьютерный микроскоп».

От теории к практике

В первую очередь нам понадобится непосредственно сама ПЗС-матрица, да ещё и подключённая к регистрирующему устройству (компьютеру). Самое дешевое конструктивное решение на этот счёт — так называемые, «веб-камеры» - небольшие устройства, подключаемые к компьютеру как правило по средствам универсальной последовательной шины, говоря проще, через USB- порт. Превоначально эти устройства служили в основном для общения в интернете, откуда и получили своё название. Для доступа к светочувствительной матрице, с них достаточно скрутить (вывернуть) объектив. С помощью них легко получить изображение на мониторе, и делать фотоснимки. Раньше, для большинства веб-камер наибольшее разрешение было 0,3 Мпкс (640 х 480), однако сейчас в продаже имеются веб-камеры, способные делать фотоснимки с разрешением 2 — 5 Мпкс. Единственный минус — как правило, низкая фактическая частота кадров при съёмке видео. Всё таки эти камеры предназначены изначально для общения в интернете, а не для съёмки кино. Если требуется микровидеосъёмка нкаких-либо объектов высокой подвижности, то можно воспользоваться камерами видеонаблюдения. Подойдут любые простые (без лишних наворотов) камеры с цветным изображением. Поскольку размер зерна (пикселей), и самих матриц довольно малы, то устанавливать камеру с ПЗС-матрицей непосредственно вместо окуляра. Увеличение будет слишком большим для используемого объектива и будет «бесполезным». Дело в том, что фактическое полезное увеличение для светового микроскопа ограничивается законами волновой оптики. Если световые волны успеют обогнуть исследуемые объекты, прежде чем пройдут объектив, то изображение будет размыто. Для оптимального полезного увеличения тубусное расстояние следует уменьшить. На сколько? Рассмотрим ниже. Чтобы совместить веб-камеру с микроскопом, необходимо с микроскопа вывернуть заводской тубус. Если он изогнут, как в большинстве моделей отечественных лабораторных микроскопов «ЛОМО» эпохи с 70х годов и более новых, то лучше отсоединить всё колено с призмой, открутив винтик сбоку. А камеру установить непосредственно сверху, ибо чем меньше компонентов использовано в оптической системе, тем меньше вероятностей возникновения различных артефактов и искажений изображения. При выборе конкретной камеры, следует учитывать форму корпуса, наиболее подходят для этого камеры с правильным цилиндрическим корпусом.

Подбор оптимального тубусного расстояния

Для подбора оптимального тубусного расстояния нам понадобятся следующие инструменты: лезвие бритвы (или подобный кусок металла с острым ровным краем), камера Горяева, установленный на микроскопе иммерсионный объектив большого увеличения (например, 90х, 100х или 120х), объективы среднего и малого увеличения (например, 40х, 20х, 10х, 8х). С помощью лезвия идёт основная подборка расстояния для достижения оптимального оптического увеличения, а с помощью камеры Горяева — тонкий настройка тубусного расстояния (если она возможна) так, чтобы соотношения между реальными размерами объекта (в микрометрах) и отображаемыми размерами (в пикселях) были относительно круглыми числами при любом объективе, это будет удобно в дальнейшей работе с компьютерным микроскопом. Для процесса подбора нужно, чтобы камера была закреплена подвижно относительно подвижной части микроскопа, на которой установлен объектив, то есть могла при необходимости двигаться вверх и вниз. Нужно подключить камеру к компьютеру, положить под микроскоп какой либо препарат, например мазок крови, Поставить малое или среднее увеличение, поймать резкость, увидеть изображение препарата на экране. В первую очередь будем определять тубусное расстояние так, чтобы добиться максимального полезного увеличения, и избежать бесполезного увеличения. Для этого, кладём на предметное стекло бритвенное лезвие (или тому подобный непрозрачный объект с острым и ровным краем), так чтобы край проходил по центру поля зрения микроскопа. Делать это лучше сперва на малом увеличении. Затем следует поставить объектив с самым большим увеличением (вроде 90х, если есть мощнее, то ставьте его), предварительно капнув иммерсионного масла (или иной иммерсионной среды, с которой обычно производится работа). Большое увеличение здесь является определяющем фактором. Найти край лезвия, так чтобы он ровно делил поле зрения на две части, тёмную и светлую. Затем поймать наилучшую резкость. Установить в настройках камеры максимальное разрешение. Сделать несколько снимков с наибольшим возможным разрешением. Для более достоверной работы, можно при проведении серии снимков можно немного поворачивать микровинт, особенно если нет уверенности в том, что резкость настроена идеально, с тем чтобы хотя бы на одном из снимков поймать наилучшую резкость. Затем следует изучить полученные снимки в сильно увеличенном масштабе, так чтобы видны были отдельные пиксели в виде квадратиков. Следует внимательно изучить границу раздела светлого и тёмного полей, отобрать снимок где она отображена наиболее чётко. Затем на этом снимке посчитать количество пикселей на границе раздела тёмной и светлой области. Если её размеры не более одного пикселя, то возможно, геометрическое увеличение не достаточно, и в этом случае следует вуеличить тубусное расстояние. Камеру нужно немного отодвинуть от объектива и повторить эксперимент. Если размеры границы раздела 3 — 5 пикселей, то геометрическое увеличение и тубусное расстояние оптимальны. Если граница сильно размыта, и её размеры больше 5 пикселей — то здесь возможно имеет место «бесполезное» увеличение. Нужно уменьшить тубусное расстояние, немного приблизив камеру к объективу микроскопа и повторить эксперимент. Очень сильно размытая граница с различимыми интерференционными минимумами и максимумами говорит о большом бесполезном увеличении (см. картинку). Подобными экспериментами следует добиться, чтобы граница раздела составляла 3-5 пикселей. При этом разрешение по пикселям немного превосходит полезное оптическое разрешение микроскопа. Это в дальнейшей работе может гарантировать нам, что возможности оптического микроскопа востребованы полностью. В среднем длина тубуса при таком подборе оказывается 4 — 8 см. Тут необходимо сделать одну заметку. Дело в том, что скорее всего при подобранным описанным выше способом тубусном расстоянии, поле обзора получаемое на экране будет меньше поля обзора наблюдаемого в окуляр. Но это в данном случае для нас не важно, ибо для большего обзора можно например поставить объектив с меньшем увеличением, зато важно другое, то что мы при таком конструктивном решении по максимуму используем возможности нашего светового микроскопа. Это даёт нам возможность исследовать и фотографировать мелкие объекты, например, клеточные включения, мелкие бактерии, крупные вирусы, и т. п. А вот производители штатных видеонасадок пошли по другому пути, они предпочли сделать так, чтобы поле обзора на экране примерно соответствовало полю обзора, видимому в окуляре, то есть чтобы ползователь видел на экране компьютера то же, что и видит в окуляре. Но такой подход несёт в себе определённые недостатки. Дело в устройстве человеческого глаза. Изображение, которое видит наш глас состоит примерно из миллиона компонентов. Учитывая, что сюда входят до кучи и палочки и три вида колбочек, то реальное полезное разрешение глаза как минимум в три раза меньше, то есть примерно соответствует 0,3 Мпкс. Но при этом в центре сетчатки глаза разрешение гораздо больше, чем по краям. Благодаря работе глазодвигательных мышц в центре оказывается тот объект, на котором человек в данный момент сконцентрировал внимание. Поэтому при большом поле обзора человек видит чётко тот объект, который в настоящий момент рассматривает, а те объекты, которые остаются в боковом зрении видны нечётко. А в случае с камерой разрешение на всём поле обзора равномерно. Поэтому полезное разрешение микроскопа со штатной видеонасадкой ниже, чем обычного микроскопа с окуляром, что делает, например, затруднительным изучение ретикулоцитов. В этом преимущество нашего конструктивного решения перед штатными промышленными видеонасадками. Теперь переходим к тонкой подборке тубусного расстояния. Для этого ставим объектив 40х. Кладём на предметный столик камеру Горяева. Ловим в поле обзора сетку, а затем её участок с малыми квадратами. Сторона малого квадрата — 50 мкм (+/-1 мкм). Далее нам желательно добиться того, чтобы её длинна на получаемом изображении составляла круглое количество пикселей. Далее нужно померить экспериментально или рассчитать соотношение между пикселями и микрометрами для каждого объектива. Зная это соотношение для каждого объектива, можно помечать масштаб на микофотографии и проводить метрологические исследования.

Програмное обеспечение.

Обычно подходят любые универсальные программы для захвата изображений, а также ПО поставляемое с веб-камерой. Но в некоторых случаях целесообразно использовать специальное ПО, например, такие программы, как «ScopePhoto», которая позволяет прямо на месте проводить метрологические и статистические исследование, отправлять результаты в MS-Excel. Пользователям операционной системы Linux я рекомендую мою собственную программу MicroCamera, она распространяется открыто и бесплатно.

Иллюстрированный мастер-класс.

Для начала, нам нужна веб-камера. Как говорилось выше, наилучшим образом подходят камеры с цилиндрическим корпусом. Вроде вот этой: Это веб камера « Ritmix» RVC-045M Далее следует аккуратно вывернуть объектив веб-камеры. Перед нами открывается светочувствительная ПЗС-матрица. Внимание! К ПЗС-матрице нельзя прикасаться руками или другими предметами, так как это может её загрязнить или даже повредить! Не следует долго держать открытой ПЗС-матрицу, во избежание попадания пыли. Любая микроскопическая пылинка попавшая на матрицу ухудшает качество изображения и вызывает артефакты на микрофотографиях! Поэтому все манипуляции с камерой без объектива следует проводить очень осторожно. Теперь нужно совместить камеру с микроскопом. В качестве опытных образцов было взято 2 микроскопа. Это микроскоп Ленинградского Оптико-Механического Объединения «ЛОМО»: И более старый микроскоп предыдущего поколения:

Далее от микроскопов следует отделить заводские тубусы. С первого микроскопа мы сняли колено с поворотной призмой: Со второго — просто отвинтили съёмную часть тубуса: После чего нужно каким либо образом приделать камеру к микроскопу. Проще всего это сделать с помощью куска подходящей по размерам резиновой трубы, так как она эластична и легко подвергается обработке (обрезке по размерам). Кроме того, возможна регуляция тубусного расстояния, движениями камеры вверх и вниз. Таким способом мы и поступим в нашем случае. Но также можно использовать пластмассу или металл, такая конструкция будет более трудоёмкой, но зато возможно более прочной. В конечном итоге получилось вот так: В итоге можно получать микрофотографии вроде этих: А с помощью специального программного обеспечения можно проводить метрологические исследования: Таким образом, с относительно небольшими материальными затратами мы получили неплохой компьютерный микроскоп.