Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему: ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПЕЧЕНИ ПРИ ЕЕ МАССИВНОЙ РЕЗЕКЦИИ И ТОКСИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Автореферат диссертации по медицине на тему ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПЕЧЕНИ ПРИ ЕЕ МАССИВНОЙ РЕЗЕКЦИИ И ТОКСИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

На правах рукописи

КОЧЕРГИН МАКСИМ ВАДИМОВИЧ

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПЕЧЕНИ ПРИ ЕЕ МАССИВНОЙ РЕЗЕКЦИИ И ТОКСИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

доктор медицинских наук,

профессор Гальперин Эдуард Израилевич

доктор медицинских наук,

профессор Липницкий Евгений Михайлович

доктор медицинских наук,

профессор Буриев Илья Михайлович

ФГУ «Институт хирургии им. A.B. Вишневского».

Зашита диссертации состоится « 09 2009 г. в на

заседании Диссертационного совета Д.208.040.03 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49).

Автореферат разослан « 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Шулутко Александр Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Повреждение печени при ее обширной резекции, токсическом или вирусном поражении связано с риском развития острой печеночной недостаточности (ОПН). ОПН является серьезным ограничивающим фактором в хирургии печени, может осложнять течение ряда внепеченочных заболеваний и сопровождается высокой летальностью [Э.И.Гальперин, 2005; С.В.Журавель, 2004; С.М.Чудных, 2000]. Эффективность современных способов лечения ОПН является достаточно низкой и, хотя большие надеяеды возлагаются на трансплантацию печени, в экстренных ситуациях такая операция трудно осуществима [С.В.Журавель, 2004; H.Bismuth, 1996].

В ряде экспериментальных работ было показано, что супернатанты (надосадочный слой, получаемый при центрифугировании гомогената печени) из регенерирующей и неонатальной печени способны усиливать регенерацию и улучшать функциональное состояние печени после ее повреждения [J. Terblanche и др., 1980; Н.Л.Сванадзе, 1984; D.R. LaBrecque и др., 1991; A.Francavilla и др., 1994; A.P.Margeli и др., 2003; K.N.Tzirogiannis и др., 2005]. Однако в данных работах имелись значительные различия в подходах к получению супернатантов, оценке их действия на печень и их очистке от балластных веществ.

Источниками супернатантов служили: печень неонатальных животных, печень животных после ее резекции, а также печень животных после ее токсического повреждения. Однако ни в одной из работ не производили сравнения супернатантов, полученных из разных источников.

Изучение действия супернатантов на печень проводили на моделях с интактной печенью, частичной деваскуляризацией печени, резекцией печени различного объема, а также с химическим повреждением печени

гепатотоксинами [T.E.Starzl и др., 1979; Н.Л.Сванадзе, 1984; A.Francavilla и др., 1987; М.Н. Mei и др., 1993; A.P.Margeli и др., 2003]. Эти модели часто были сложными и дорогими с позиций их пригодности для оценки действия супернатантов на печень.

Методы оценки действия супернатантов включали оценку синтеза ДНК по включению меченного тритием тимидина, подсчет числа митозов в печени, определение активности AJIT и ACT в сыворотке крови, а также определение содержания холестерина и желчных кислот в желчи [Н.Л.Сванадзе, 1984; D.R. LaBrecque и др., 1987; A.Francavilla и др., 1994; S.E.Theocharis и др., 1998; K.N.Tzirogiannis и др„ 2005]. Как правило, исследователи использовали сочетание нескольких тестов, и ни в одной из работ не производили сравнения оценочных методов с целью выбора наиболее простого и информативного теста.

Исследования по изучению восстановления печени показали, что исключение из процесса одного из факторов регенерации в большинстве случаев приводит к нарушению всего процесса регенерации [А. Blindenbacher и др., 2003; М.М. Markiewski и др., 2004; A. Natarajan и др., 2007; Y. Yamada и др., 1998; A. Wullaert и др., 2007]. В связи с этим, мы предположили, что для восстановления печени после повреждения необходима сбалансированная совокупность присутствующих в регенерирующей или неонатальной печени активных ингредиентов. Получение такой совокупности в составе супернатанта для дальнейшей его очистки требует выявления оптимального источника получения достаточно большого количества супернатантов, разработки простой и дешевой модели повреждения печени, а также выбора быстрого и информативного метода оценки действия супернатантов на печень.

• улучшить состояние печени после ее обширной резекции или токсического повреждения под действием супернатантов, полученных из регенерирующей или неонатальной печени в эксперименте.

• разработать простую и дешевую модель повреждения печени, удобную для изучения действия супернатантов;

• определить быстрый и информативный метод оценки действия супернатантов на поврежденную печень;

• оценить действие супернатантов, полученных из печени крысы после ее 70% резекции, из печени крысы после ее токсического повреждения, а также из печени неонатального поросенка;

• установить оптимальный источник получения супернатантов для их последующей очистки от балластных веществ.

Научная новизна работы

Супернатанты, полученные из печени крысы после ее 70% резекции или токсического повреждения, а также супернатант, полученный из печени неонатального поросенка, позволяют улучшить состояние пораженной печени и ускорить ее восстановление.

Супернатант из печени неонатального поросенка обладает той же восстановительной способностью, что и супернатант, полученный из регенерирующей печени крысы.

Максимальное действие супернатантов, полученных из печени крысы после ее резекции или токсического повреждения, начинает проявляться спустя 24 - 36 ч, тогда как действие супернатанта из печени неонатального поросенка - через 48 ч. К этому времени эффекты всех трех супернатантов практически одинаковы.

Практическое значение работы

Разработана модель токсического повреждения печени мышей, которая позволяет получать результаты, сходные с таковыми на двух других крысиных моделях, являясь при этом наиболее простой и дешевой.

Установлена более высокая информативность метода оценки состояния печени по активности ACT и AJIT в крови по сравнению с методом оценки по остаточной концентрации ИЦЗ в крови.

Показано, что оптимальным источником получения супернатанта, пригодного для последующей очистки, является печень неонатального поросенка, использование которой позволяет получать супернатант в больших количествах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Модели 70% резекции печени у крыс, повреждения печени тиоацетамидом у крыс и мышей являются адекватными для изучения возможности восстановления поврежденной печени при действии супернатантов.

2. Наиболее простой и дешевой является модель повреждения печени тиоацетамидом у мышей.

3. Определение активности ACT и AJIT в сыворотке крови животных является информативным методом оценки действия супернатантов при повреждении печени.

4. Введение супернатантов из печени крысы после 70% резекции и неонатальной печени поросенка животным после повреждения печени приводит к значимому уменьшению степени повреждения печени и позволяет ускорить ее восстановление.

5. Эффекты супернатантов, полученных из печени крысы после 70% резекции, печени крысы после токсического повреждения и печени неонатального поросенка, являются примерно одинаковыми.

6. Оптимальным источником получения супернатанта является печень неонатального поросенка, использование которой позволяет получать супернатант в больших количествах.

По материалам диссертации опубликовано две работы.

Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции с международным участием «Успенские чтения» (Тверь, 2008).

Апробация работы проведена на совместном заседании курса хирургической гепатологии при кафедре хирургии ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова и отдела хирургии печени НИЦ ММА им. И.М. Сеченова.

Структура п объем работы

Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов с их обсуждением, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 255 источников (12 отечественных и 243 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 45 таблицами и 47 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено несколько серий экспериментов на крысах, мышах и поросятах. Общие данные по проведенным экспериментам представлены в таблице.

№ п/п Группы опытов Вид животного Вес N

1 Получение супернатанта из печени крысы после ее 70% резекции Крыса 130-160 г 25

2 Получение супернатанта из печени крысы после ее повреждения ТАА Крыса 130-160 г 25

3 Получение супернатанта из печени неонатального поросенка Поросенок 1,5-2 кг 10

4 Разработка модели 70% резекции печени Крыса 130-160 г 47

5 Разработка модели повреждения печени ТАА Крыса 130-160 г 111

6 Разработка модели повреждения печени ТАА Мышь 18-20 г 92

7 Восстановление печени при действии супернатантов на модели 70% резекции печени Крыса 130-160 г 41

8 Восстановление печени при действии супернатантов на модели токсического повреждения ТАА Крыса 130-160 г 33

9 Восстановление печени при действии супернатантов на модели токсического повреждения ТАА Мышь 18-20 г 264

Всего Крысы 282

Забор печени для приготовления супернатантов

Забор печени производили у самцов половозрелых крыс и самцов 2 -3-дневных поросят. Для получения в супернатанте из печени крысы высокой концентрации активных веществ проводили 70% резекцию печени или создавали повреждение печени тиоацетамидом (ТАА).

70% резекцию печени у крыс проводили по методике G.M. Higgens и R.M. Anderson (1931): под эфирным наркозом удаляли срединную и левую латеральную доли печени после перевязки их сосудисто-секреторной ножки. Через 48 ч после операции животных забивали декапитацией и канюлировали воротную вену. Оставшуюся часть печени забирали после промывания холодным физиологическим раствором.

Для создания токсического повреждения печени у крыс производили однократное внутрибрюшинное введение ТАА в дозе 400 мг/кг. Через 24 ч

после введения ТАА животных забивали, обескровливали и производили забор печени. Однако небольшой размер печени крысы, который дополнительно уменьшался после ее резекции, позволял получить лишь небольшое количество супернатанта. В связи с этим для получения больших количеств супернатанта с высоким содержанием активных веществ в качестве второго его источника использовали печень 2-3-дневного поросенка. Для забора последней под внутрибрюшинным наркозом 5 мл 5% р-ра гексенала выполняли лапаротомию в правом подреберье и производили мобилизацию печени. Затем проводили перфузию печени холодным физиологическим раствором, пересекали нижнюю полую вену и печеночно-двенадцатиперстную связку со всеми ее элементами и производили забор печени на фоне продолжающейся перфузии.

После забора печени производили приготовление супернатанта. При этом основной задачей было получить естественную сбалансированную совокупность биологически активных веществ, способную ускорить восстановление поврежденной печени.

Донорскую печень гомогенизировали с дистиллированной водой в соотношении 1:3 при 8000 об/мин в течение 1 мин. С целью отделения клеточных ядер и фрагментов клеточных мембран полученный гомогенат центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин и 4°С. Для инактивации ферментов и других термолабильных белков надосадочную жидкость прогревали в течение 15 мин при 100°С и охлаждали. Затем с целью осаждения балластных белков к одному объему супернатанта добавляли 6 объемов 95,5% этанола. Полученную смесь выдерживали на холоде в течение 2 ч, а затем повторно центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин и 4°С. Полученный преципитат растворяли в

дистиллированной воде и снова центрифугировали при тех же условиях. Полученный супернатант хранили в морозильной камере при -20°С.

Разработка модели повреждения печени

При разработке модели повреждения печени использовали крыс и мышей. На крысах были разработаны модель 70% резекции печени и модель токсического повреждения печени ТАА, на мышах - модель токсического повреждения печени ТАА. В качестве оценочного метода с самого начала использовали определение активности ACT и AJIT в сыворотке крови, так как последняя, как было показано [А.Р. Margeli и др., 2003], положительно коррелирует с выраженностью повреждения печени при гистологическом исследовании. Для наглядности дополнительно рассчитывали индексы повреждения печени по ACT и AJIT. Расчет индекса повреждения печени как по ACT, так и по AJIT проводили по формуле:

((Результат в группе с повреждением печени) - (Результат в интактной группе)) / Результат в интактной группе.

Общий индекс повреждения печени рассчитывали по формуле: (Индекс повреждения печени по ACT + Индекс повреждения печени по AJIT) / 2.

При разработке модели 70% резекции печени у крыс сравнивали активность ACT и AJIT в крови у интактных крыс и крыс через 6, 12 и 18 ч после 70% резекции.

При разработке модели повреждения печени ТАА у крыс активность трансаминаз оценивали у интактных крыс, крыс после однократного введения ТАА в дозе 400 мг/кг и двукратного введения ТАА в дозах

400, 800, 1000 и 1200 мг/мл. У крыс с двукратным введением ТАА в дозе 400 мг/кг забор крови осуществляли через 12 и

18 ч. Во всех остальных группах забор крови осуществляли через 12 ч после второго введения ТАА.

Модель повреждения печени ТАА у мышей была разработана по аналогии с моделью токсического повреждения печени у крыс, исходя из соображений максимально упростить модель и уменьшить ее стоимость. Оценку активности ACT и АЛТ производили у интактных мышей и у мышей после однократного введения ТАА в дозах 150 и 250 мг/кг. Забор крови осуществляли через 12, 24, 36 и 48 ч.

Выбор метода оценки состояния печени

Оценка состояния печени по активности ACT и АЛТ в сыворотке крови

Для определения активности ACT и АЛТ в сыворотке крови животных использовали наборы реактивов «Диаком ACT» и «Диаком АЛТ» соответственно (производство ЗАО «ДИАКОМ-ВНЦМДЛ», Москва, Россия). Определение активности ACT и АЛТ основывалось на регистрации уменьшения оптической плотности опытного образца по сравнению с контролем при 340 нм.

Разработка метода оценки состояния печени по остаточной концентрации индоцианового зеленого в крови

Метод оценки функции печени по остаточной концентрации индоцианового зеленого (ИЦЗ) в крови широко используется в клинической практике [McCormack и др., 2008]. Кроме того, имеются сообщения о возможности его применения у мелких животных [F.Inage и др.,1997; L.F.Rikkers и др., 1974]. Исходя из этого, мы сравнили остаточные концентрации ИЦЗ на 7-й минуте после его введения в крови

крыс после повреждения печени ТАА с таковыми интактных крыс и по аналогии с расчетом индексов повреждения по ACT и AJIT рассчитали индекс повреждения по ИЦЗ. Выведение ИЦЗ из организма осуществляется исключительно печенью с желчью. В связи с этим при ухудшении состояния печени выведение ИЦЗ уменьшается, и его концентрация в плазме крови увеличивается. Использовали порошок ИЦЗ ICG-PULSION® во флаконах по 5 и 10 мг (производство PULSION Medical Systems AG, Мюнхен, Германия). Введение раствора крысам проводили в концентрации 5 мг/мл под эфирным наркозом в нижнюю полую вену. До введения, а также через 7 мин после введения производили забор образцов крови. Кровь в объеме 0,5-1 мл собирали в градуированные пробирки с цитратом натрия. Содержание цитрата натрия по отношению к крови составляло 1:5. Пробирки с кровью и цитратом натрия аккуратно переворачивали несколько раз, центрифугировали и получали плазму. После этого измеряли оптическое поглощение образцов с помощью спектрофотометра СФ-46 (производство фирмы «Ломо», Санкт-Петербург, Россия) при длине волны Л =800 нм. Концентрацию ИЦЗ в образцах определяли по калибровочной кривой.

Сравнение методов оценки состояния печени по активности ACT и АЛТи по остаточной концентрации ИЦЗ в крови

Сравнение методов оценки состояния печени по активности АЛТ и ACT и по концентрации ИЦЗ проводили путем оценки достоверности различий между опытной и контрольной группами, расчета индексов повреждения печени для каждого из указанных методов, а также путем оценки корреляционной связи между уровнями активности ACT и АЛТ и концентрацией ИЦЗ.

Оценка действия супернатантов

На следующем этапе была оценена возможность восстановления поврежденной печени под действием супернатантов, полученных из резецированной печени крысы, печени крысы после ее токсического повреждения, а также печени неонатального поросенка. Действие супернатантов во всех экспериментах оценивали путем сравнения активности ACT и AJIT в опытной и контрольной группах, а также по рассчитанному индексу восстановления печени. Расчет последнего как по ACT, так и по AJIT производили по формуле:

((Результат в контрольной группе) - (Результат в опытной группе)) / Результат в контрольной группе.

Общий индекс восстановления печени рассчитывали по формуле:

(Индекс восстановления печени по ACT + Индекс восстановления печени по АЛТ) / 2.

На модели 70% резекции печени у крыс супернатант вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 3,8 мл/150 г веса непосредственно после резекции печени. Животным контрольной группы непосредственно после 70% резекции печени вводили 3,8 мл физиологического раствора. Забор крови осуществляли через 12 ч после операции.

На модели токсического повреждения печени крыс ТАА супернатант вводили внутрибрюшинно в дозе 3,8 мл/150 г веса через 2 ч после каждого введения ТАА. Животным контрольной группы вводили эквивалентное количество физиологического раствора. Забор крови осуществляли через 12 ч после второго введения ТАА.

На модели токсического повреждения печени мышей ТАА супернатант вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 0,46 мл/20 г веса

через 2 ч после введения ТАА. Животным контрольной группы вводили эквивалентное количество физиологического раствора. Забор крови осуществляли через 36 и 48 ч после введения ТАА.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного обеспечения SPSS 9.0 для Windows.

Для определения метода статистической обработки результатов оценили распределение уровней активности ACT и AJIT. В связи с некомпактным и асимметричным распределением переменных значения активности ACT и AJIT были проранжированы, и достоверность различий средних рангов между группами определяли с помощью дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Модели повреждения печени

Модель 70% резекции печени у крыс

70% резекция печени приводила к достоверному увеличению активности ACT и АЛТ в крови через 12 ч по сравнению с интактными крысами (р<0,001). Активность трансаминаз через 12 ч была выше таковой через 6 и 18 ч (рис.1), при этом различие было недостоверным в первом случае (р>0,05) и достоверным во втором случае (р<0,001 для ACT и р=0,008 для АЛТ).

Рис. 1. Активность ACT и AJIT в сыворотке крови у интактных крыс (0) и у крыс в различное время после 70% резекции печени

На основании полученных результатов было решено производить забор крови через 12 ч. Общий индекс повреждения печени через 12 ч составил 9,33.

Таким образом, модель 70% резекции печени у крыс заключалась в удалении 70% паренхимы с забором крови через 12 ч.

Модель повреждения печени ТАА у крыс

Однократное введение ТАА с забором крови через 12 ч приводило к повышению активности ACT и AJIT в крови по сравнению с интактными крысами, однако различие между группами было недостоверным. Общий индекс повреждения печени (0,25) был значительно ниже такового для модели 70% резекции печени (9,33). С увеличением кратности введения ТАА до 2 раз в дозе 400 мг/кг и забором крови через 12 ч активность ACT и AJIT в группе крыс с двукратным введением ТАА была достоверно выше таковой в группе интактных крыс (р<0,001). Общий индекс повреждения печени также был значительно выше, чем при однократном введении ТАА (17,4 по сравнению с 0,25). Активность ACT и AJIT в крови крыс через 18 ч была несколько ниже, чем через 12 ч, причем различие было недостоверным (р>0,05). Кроме того, среднеквадратические отклонения и статистические погрешности средних рангов активности ACT и AJIT были

выше в группе с забором крови через 18 ч. Исходя из этого, было решено проводить забор крови у крыс через 12 ч после второго введения ТАА.

При двукратном введении ТАА в дозе 800 мг/кг активность ACT и AJIT была несколько выше таковой при введении ТАА в дозе 400 мг/кг, однако различие между группами было недостоверным (р>0,1). Кроме того, в группе с введением ТАА в дозе 800 мг/кг среднеквадратическое отклонение было выше, чем в группе с введением ТАА в дозе 400 мг/кг. При введении ТАА в дозе 1000 мг/кг активность ACT была достоверно ниже (р=0,001) таковой при введении ТАА в дозе 400 мг/кг. Активность АЛТ при введении ТАА в дозе 1000 мг/кг была также ниже таковой при введении ТАА в дозе 400 мг/кг, однако достоверность различий была низкой (р=0,52). В группе с введением ТАА в дозе 1200 мг/кг летальность через 12 ч составила 100%, в связи с чем сравнение с данной группой не проводилось. Исходя из полученных данных, в качестве оптимальной была выбрана доза ТАА 400 мг/кг (рис. 2).

О 400 800 1000 1200 мг/кг мг/кг мг/кг мг/кг

Рис.2. Активность ACT и AJ1T в сыворотке крови у интактных крыс (0) и у крыс после двукратного внутрибрюшинного введения ТАА в различных дозах

Таким образом, модель токсического повреждения печени у крыс заключалась в двукратном внутрибрюшинном введении ТАА с интервалом 24 ч в дозе 400 мг/кг с забором крови через 12 ч после второго введения ТАА.

Модель повреждения печени ТАА у мышей

Оценка активности ACT и АЛТ у интактных мышей и у мышей через 24 ч после введения ТАА в дозах 150 и 250 мг/кг показала, что введение ТАА в обеих дозах приводило к достоверному увеличению активности ACT и АЛТ в крови (р<0,001) по сравнению с интактными животными. Однако различие активности ACT и АЛТ в группах с введением ТАА в дозах 150 и 250 мг/кг было недостоверным (р>0,05). Кроме того, индекс повреждения печени был несколько выше при введении ТАА в дозе 150 мг/кг (13,2 по сравнению с 12,24). На основании полученных результатов была выбрана доза ТАА 150 мг/кг.

Оценка активности трансаминаз в различные моменты времени (рис. 3) показала, что активность ACT и АЛТ через 24 ч была выше таковой через 12 ч, при этом различие было недостоверным для ACT (р>0,05) и достоверным для АЛТ (р<0,001). В то же время активность ACT и АЛТ через 36 и 48 ч была достоверно выше таковой через 12 и 24 ч (р<0,001). В связи с этим забор крови стали производить через 36 и 48 ч.

Таким образом, модель повреждения печени ТАА у мышей заключалась в однократном внутрибрюшинном введении ТАА в дозе 150 мг/кг с забором крови через 36 и 48 ч.

2000 1500 1000 5000-

0 12ч 24ч 36 ч 48ч

Рис.3. Активность ACT и АЛТ в сыворотке крови у интактных мышей (0) и у мышей после внутрибрюшинного введения ТАА в дозе 150 мг/кг в различные моменты времени

Выбор метода оценки состояния печени

При оценке состояния печени по остаточной концентрации ИЦЗ в крови было установлено, что при введении ТАА в дозе 400 мг/кг остаточная концентрация ИЗЦ в крови крыс была достоверно выше (р<0,05) таковой у интактных крыс (рис. 4), а индекс повреждения печени по ИЦЗ составил 0,4.

Для сравнения двух оценочных методов измерили активность ACT и AJIT в тех же группах животных (рис. 5), после чего сравнили достоверности различий и индексы повреждения для двух методов.

Интактные Крысы после крысы введенияТАА

Рис. 4. Содержание ИЦЗ через 7 мин после введения в крови у интактных крыс и у крыс после двукратного внутрибрюшинного введения ТАА в дозе 400 мг/кг

Интактные Крысы после крысы введения ТАА

Рис. 5. Активность ACT и AJ1T в крови у интактных крыс и у крыс после двукратного внутрибрюшинного введения ТАА в дозе 400 мг/кг

Достоверность различий между группами была выше при оценке по активности ACT и AJ1T (р<0,001) по сравнению с оценкой по остаточной концентрации ИЦЗ (р<0,05). Так как количество экспериментальных животных для обоих оценочных методов было одинаковым, большая достоверность различий соответствовала большей силе связи. После этого мы оценили корреляцию рангов активности ACT и AJIT с уровнем ИЦЗ, рассчитав коэффициент корреляции Спирмана. Уровень ИЦЗ, отражающий выделительную функцию печени, положительно коррелировал с активностью ACT и AJIT, отражающими степень повреждения печени (р=0,13 и р=0,02 соответственно). При этом корреляционная связь ACT с АЛТ оказалась значительно сильнее, чем их связи с ИЦЗ, что соответствует предположению о том, что активность ACT и АЛТ является более точным маркером степени повреждения печени. Учитывая полученные результаты и большую сложность метода оценки остаточной концентрации ИЦЗ в лабораторных условиях, в качестве основного метода оценки состояния печени было выбрано определение активности ACT и АЛТ в сыворотке крови.

Восстановление поврежденной печени под действием супернатантов

Сначала оценили эффект супернатанта из резецированной печени крысы на трех разработанных моделях, чтобы на основании полученных результатов выбрать одну наиболее подходящую модель для проведения последующих экспериментов.

Оценка действия супернатанта из печени крысы после 70% резекции

На модели 70% резекции печени введение СК-Р приводило к снижению активности ACT и АЛТ в сыворотке крови по сравнению с

контролем (рис. 6), при этом различие было достоверным для ACT (р<0,05) и низкодостоверным для АЛТ (р=0,053). Общий индекс восстановления печени составил 0,21.

Рис. 6. Активность ACT и АЛТ в сыворотке крови крыс опытной (введение СК-Р) и контрольной групп на модели 70% резекции печени

На модели токсического повреждения печени у крыс введение СК-Р также приводило к снижению активности трансаминаз в сыворотке крови по сравнению с контролем (рис. 7), при этом различие между группами было высокодостоверным (р<0,001), а общий индекс восстановления печени составил 0,31.

Рис. 7. Активность ACT и АЛТ в сыворотке крови крыс опытной (введение СК-Р) и контрольной групп на модели повреждения печени

На модели токсического повреждения печени у мышей введение СК-Р приводило к снижению активности ACT и АЛТ в крови по сравнению с

контролем (рис. 8). При этом различие было высокодостоверным (р<0,001) и через 36, и через 48 ч. Индекс восстановления печени через 48 ч (0,31) был выше такового через 36 ч (0,21), что свидетельствовало о более выраженном эффекте супернатанта через 48 ч. Кроме того, индекс восстановления печени через 36 ч был равен таковому на модели 70% резекции печени, а индекс восстановления печени через 48 ч был равен таковому на модели токсического повреждения печени крыс ТАА.

1600f' 1400 1200 1000

Рис. 8. Активность ACT и АЛТ в сыворотке крови у мышей опытной (введение СК-Р) и контрольной групп на модели повреждения печени ТАА через 36 ч (а) и 48 ч (б)

Таким образом, введение супернатанта из регенерирующей печени крысы приводило к восстановлению печени после ее 70% резекции и токсического повреждения.

На основании полученных результатов для последующих экспериментов была выбрана модель повреждения печени ТАА у мышей. Такой выбор обосновывался следующими соображениями: из трех полученных моделей повреждения печени данная модель является наиболее простой, так как не требует выполнения резекции печени (в отличие от модели 70% резекции печени) и требует лишь однократного внутрибрюшинного введения ТАА (в отличие от модели токсического повреждения печени у крыс) в более низкой дозе; индексы восстановления печени для СК-Р на модели токсического повреждения печени у мышей

были сходны с таковыми на модели 70% резекции печени у крыс (при заборе крови через 36 ч) и на модели токсического повреждения печени у крыс (при заборе крови через 48 ч); расход супернатантов на модели токсического повреждения печени у мышей был меньше такового на двух других моделях; кроме того, использование мышей вместо крыс позволяет сделать модель более дешевой.

Оценка действия супернатанта из печени крысы после ее повреждения ТАА (СК-ТАА)

Введение СК-ТАА, как и введение СК-Р, приводило к достоверному снижению активности ACT и AJIT в крови животных через 36 ч по сравнению с контролем (рис. 9а). При этом достоверность различий с контрольной группой была выше при введении СК-ТАА (р<0,001), чем при введении СК-Р (р<0,05). При сравнении активности ACT и AJIT в двух опытных группах оказалось, что последняя в группе с введением СК-ТАА была достоверно ниже таковой в группе с введением СК-Р (р<0,001). Таким образом, эффект СК-ТАА через 36 ч был более выраженным по сравнению с СК-Р, что дополнительно подтверждалось при сравнении индексов восстановления печени (0,54 для СК-ТАА по сравнению с 0,17 для СК-Р).

Через 48 ч картина была несколько иной (рис. 96). Так же как и через 36 ч, активность ACT и AJIT в обеих опытных группах (при введении СК-ТАА и СК-Р) была достоверно ниже таковой в контрольной группе (р<0,001 для СК-Р по сравнению с контролем; р=0,006 для ACT и р<0,001 для AJIT в группе СК-ТАА по сравнению с контролем). В то же время при сравнении двух опытных групп активность ACT и AJIT была несколько ниже в группе с введением СК-Р, однако различие было недостоверным (Р>0,1).

Таким образом, эффекты СК-ТАА и СК-Р через 48 ч были сопоставимы, что дополнительно подтверждалось при сравнении индексов восстановления печени через 48 ч (0,35 для СК-ТАА и 0,4 для СК-Р).

1600 ' 1400 ' 1200 ' 1000- ' 800' 600 400' 2000-

Рис. 9. Активность ACT и АЛТ в сыворотке крови у мышей опытных (введение СК-ТАА и введение СК-Р) и контрольной групп на модели повреждения печени ТАА через 36 ч (а) и 48 ч (б)

Оценка действия супернатанта из печени неонатального поросенка

Активность ACT и АЛТ в группе с введением СП через 36 ч была несколько ниже таковой в контрольной группе (рис. 10а), однако различие было недостоверным (р>0,05). В то же время в опытной группе с введением СК-Р активность ACT и АЛТ была достоверно ниже таковой в контрольной группе (р<0,001), что согласуется с полученными ранее данными. Активность ACT и АЛТ в крови животных с введением СК-Р через 36 ч была также достоверно ниже таковой в группе с введением СП (р<0,05). Слабо выраженный эффект СП через 36 ч дополнительно подтверждался при сравнении индексов восстановления печени (0,05 для СП по сравнению с 0,18 для СК-Р).

В отличие от показателей через 36 ч активность ACT и АЛТ через 48 ч в группе с введением СП была достоверно ниже таковой в контрольной группе (р<0,001; рис. 106). Показатели в опытной группе с

введением СК-Р были также достоверно ниже таковых в контрольной группе (р<0,001), что согласовалось с полученными ранее данными. При сравнении групп с введением СП и СК-Р через 48 ч активности ACT и AJIT были сопоставимы, а различие между группами было недостоверным (р>0,05).

Таким образом, эффект СП проявлялся лишь через 48 ч после введения ТАА и был сопоставим с таковым СК-Р, что дополнительно подтверждалось при сравнении индексов восстановления печени (0,35 для СП по сравнению с 0,36 для СК-Р).

Рис.10. Активность ACT и АЛТ в сыворотке крови у мышей опытных (введение СП и введение СК-Р) и контрольной групп на модели повреждения печени ТАА через

36 ч (а) и 48 ч (б)

Результаты сравнения показали, что эффекты супернатантов, полученных из печени крысы после ее 70% резекции или токсического повреждения, проявляются уже через 36 ч, при этом эффект супернатанта из печени крысы после ее токсического повреждения превосходит таковой супернатанта из резецированной печени крысы. Эффект супернатанта из печени неонатального поросенка через 36 ч еще слабо выражен. Однако через 48 ч эффекты всех трех супернатантов уже сходны между собой (индексы восстановления печени 0,36; 0,35 и 0,35 для СК-Р, СК-ТАА и СП соответственно).

Таким образом, суиериатанты, полученные из печени крысы после ее 70% резекции или токсического повреждения, а также супернатант, полученный из печени неонатального поросенка, усиливают восстановление пораженной печени уже через 36—48 ч, о чем свидетельствуют достоверно более низкие уровни активности ACT и AJ1T в опытных группах по сравнению с контролем.

Исходя из того, что эффекты трех изучаемых супернатантов через 48 ч были приблизительно одинаковы, в качестве наиболее оптимального источника супернатанта была выбрана печень неонатального поросенка. Использование последней позволяет получать значительно большие количества супернатанта, чем при использовании печени крысы, а также исключает необходимость предварительного повреждения печени путем ее резекции или введения гепатотоксина. Последнее обстоятельство может иметь большое значение при необходимости получения супернатанта в больших количествах.

1. Супернатанты, полученные из резецированной печени крысы, печени крысы после токсического повреждения и печени неонатального поросенка, обладают способностью улучшать состояние печени после ее 70% резекции или повреждения ТАА.

2. Разработанная модель повреждения печени у мышей с внутрибрюшинным введением ТАА в дозе 150 мг/кг и забором крови через 48 ч является простой, дешевой и удобной для оценки действия различных супернатантов.

3. Остаточная концентрация ИЦЗ в крови на 7-й минуте достоверно отражает степень повреждения печени при действии на нее ТАА.

4. Метод оценки действия супернатантов по активности ACT и АЛТ в сыворотке крови является простым, информативным и удобным для

5. Оптимальным источником получения супернатанта является печень неонатального поросенка. Ее использование позволяет получать большие количества супернатанта и исключает необходимость предварительного повреждения печени.

Публикации по теме диссертации

1. Гальперин Э.И., Дюжева Т.Г., Платонова Л.В., Атауллаханов Р.И., Ионочкина H.H., Погосян Г.С., Кочергин М.В. Уменьшение повреждения печени при ее обширной резекции и токсическом поражении в эксперименте //Анналы хирургической гепатологии. -2008. - Т.О., №1. - С. 51-56.

2. Дюжева Т.Г., Платонова Л.В., Кочергин М.В., Ионочкина H.H. Восстановление функции печени в ранние сроки после повреждения //Социальные аспекты хирургической помощи населению в современной России: Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием (Успенские чтения, выпуск 5). - Тверь, 2008. - С. 173-174.

Список сокращений и обозначений

АЛТ - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза ИЦЗ - индоциановый зеленый ОПН - острая печеночная недостаточность СК-Р - супернатант из печени крысы после 70% резекции СК-ТАА - супернатант из печени крысы после ее повреждения тиоацетамидом

СП - супернатант из печени неонатального поросенка

Оглавление диссертации Кочергин, Максим Вадимович :: 2009 :: Москва

Список сокращений и обозначений.

Глава 1. Восстановление печени при действии супернатантов из крови и печени животных (обзор литературы).

1. История вопроса.

1.1 Опыты на животных-парабионтах.

1.2 Опыты с перекрестным кровообращением.

1.3 Опыты с (ауто)трансплантацией ткани печени.

1.4 Опыты с введением сыворотки или плазмы животных после резекции печени.

1.5 Опыты, с введением экстракта печени.

2. Понятие о факторах роста.

2.1. Основные факторы роста.

2.2. Восстановление печени в отсутствие отдельных факторов.

3. Супернатанты и способы их очистки от балластных веществ.

3.1. Принцип получения»супернатанта.23 v

3.2. Супернатант из.сыворотки (плазмы) крови.

3.3. Супернатант из печени после ее резекции или химического повреждения.24 53.4 Подходы к очистке супернатантов от балластных веществ.

4. Модели для изучения возможности восстановления печени под действием различных супернатантов.

4.1. Модели in vitro.

4.2. Модели in vivo.

5. Методы оценки восстанавливающего действия супернатантов на печень

5.1. Оценка синтеза ДНК.

5.2. Оценка числа митозов.

5.3. Оценка повреждения печени по активности ферментов.

5.4. Оценка функции печени.

Введение диссертации по теме "Хирургия", Кочергин, Максим Вадимович, автореферат

Острая печеночная недостаточность (ОПН) нередко является конечной стадией многих заболеваний печени, осложняет течение внепеченочных заболеваний (таких как перитонит, деструктивный панкреатит, сепсис и др.) [12], а также является серьезным ограничивающим фактором в хирургии печени [3].

Чаще всего факторами, вызывающими ОПН, являются вирусные гепатиты, отравление лекарственными средствами или гепатотоксичными ядами и др. [7]. Кроме того, ОПН, как правило, возникает после обширных резекций печени, превышающих 60% нормальной паренхимы [8]. Это обстоятельство во многих случаях существенно ограничивает возможность радикальной операции. Еще более остро проблема развития ОПН после8 резекции печени стоит у больных с циррозом печени [8]. В таких случаях шансы больных на радикальную операцию еще ниже. Варианты' консервативного лечения острой печеночной недостаточности в настоящее время ограничены и представлены медикаментозным лечением и активными* методами детоксикации [7]. В последнее время возможности лечения больных с острой печеночной недостаточностью несколько расширились в связи с внедрением в практику экстренной ортотопической трансплантации печени [7]. Однако дефицит органов и наличие противопоказаний делает этот вариант лечения доступным лишь для небольшого числа больных [7]. Использование экстракорпоральных систем детоксикации позволяет лишь незначительно увеличить данный показатель [20]. Таким образом, летальность при ОПН с учетом всех современных методов лечения, составляет, по данным разных авторов, от 50 до 90% [7]. Возможности предоперационной профилактики ОПН в настоящее время ограничены эмболизацией или перевязкой ветвей воротной вены [11]. Однако этот способ также имеет свои ограничения и применим лишь у определенного числа больных. Из изложенного выше можно заключить, что, несмотря на весь арсенал имеющихся в настоящее время методов, лечение острой печеночной недостаточности продолжает представлять серьезную проблему. В связи с этим- актуальным является поиск методов лечения и профилактики этого состояния:

В то же время, широко- известно, что печень имеет большую способность к регенерации и быстрому восстановлению- функционального состояния1 паренхимы, и уже через 10-12 дней после резекции объем оставшейся паренхимы может увеличиваться вдвое. К этому времени угроза печеночной недостаточности уже минимальна [3]. Возможность оказать стимулирующее влияние на восстановление печени в критический момент позволила бы, избежать многих осложнений и, неприятных исходов, а также увеличить объемы резекций печени.

• > Улучшить состояние печени после ее обширной; резекции или токсического повреждения под действием супернатантов, полученных из регенерирующей или неонатальной печени в эксперименте.

• разработать простую и дешевую модель повреждения печени, удобную для изучения действия супернатантов;

• определить быстрый и информативный метод оценки действия супернатантов на поврежденную печень;

• оценить действие супернатантов, полученных, из печени крысы после ее 70%. резекции, из печени крысы после ее токсического повреждения, а также из»печени1 неонатального * поросенка;

• установить оптимальный источник получения1 супернатантов для их последующей очистки от балластных веществ.

Научная новизна работы

Максимальное действие супернатантов, полученных из печени крысы после ее резекции или токсического повреждения начинает проявляться спустя 24-36 ч, тогда как действие супернатанта из печени неонатального поросенка - через 48 ч. К этому времени эффекты всех трех супернатантов практически одинаковы.

Практическое значение работы

Разработана модель токсического повреждения печени'мышей, которая позволяет получать результаты, сходные с таковыми1 на двух других-крысиных моделях, являясь при этом наиболее простой и дешевой.

Установлена более высокая информативность метода оценки состояния печени по активности ACT и AJ1T в крови по сравнению с методом оценки по остаточной концентрации индоцианового зеленого (ИЦЗ) в крови.

Оптимальным источником получения супернатанта, пригодного для последующей очистки, является печень неонатального поросенка, использование которой позволяет получать супернатант в больших количествах.

Основныеположения, выносимые на защиту

1. Модели* 70% резекции печени у крыс, повреждения печени тиоацетамидом у крыс и мышей являются адекватными для изучения возможности восстановления поврежденной печени при действии супернатантов.

2. Наиболее простой и дешевой является модель повреждения печени тиоацетамидому мышей.

3. Определение активности ACT и AJIT в сыворотке крови животных является информативным методом оценки действия супернатантов при повреждении! печени.

4. Введение супернатантов из печени крысы после 70* % резекции, и неонатальной печени поросенка животным после повреждения- печешь приводит к значимому уменьшению степени повреждения печени и позволяет ускорить ее восстановление.

5. Эффекты супернатантов, полученных из печени крысы после 70% резекции, печешг крысы после токсического повреждения и печени г неонатального поросенка являются примерно одинаковыми. ;

6. Оптимальным источником получения супернатанта является1 печень, неонатального поросенка, использование которой1 позволяет получать^ супернатант в больших количествах. г '

По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Материальг диссертации доложены на Всероссийской научной конференции-с международным участием Успенские чтения (Тверь, 2008).

Апробация работы проведена на совместном заседании курса хирургической^ гепатологии при кафедре хирургии ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова и отдела хирургии печени НИЦ ММА им. И:М'. Сеченова.

Структура и объем работы

Заключение диссертационного исследования на тему "ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПЕЧЕНИ ПРИ ЕЕ МАССИВНОЙ РЕЗЕКЦИИ И ТОКСИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ"

2. Разработанная модель повреждения' печени у мышей с внутрибрюшинным введением тиоацетамида в дозе 150 мг/кг и забором крови через 48 ч является простой, дешевой и удобной для оценки действия различных супернатантов.

3. Остаточная концентрация ИЦЗ в крови на 7 минуте достоверно отражает степень повреждения печени при действии на нее ТАА.

4. Метод оценки действия супернатантов по активности ACT и АЛТ в сыворотке крови является простым, информативным и удобным для1 изучения повреждения печени и возможности улучшения ее состояния при действии супернатантов. Активность ACT и АЛТ в крови является более точным маркером повреждения печени, чем остаточная концентрация ИЦЗ.

Повреждение печени вследствие ее обширной резекции, токсического или вирусного поражения связано с риском развития ОПН, которая является-серьезным ограничивающим фактором в хирургии печени, может осложнять < течение ряда внепеченочных заболеваний (таких как перитонит, деструктивный панкреатит, сепсис и. др.) и сопровождается, высокой' летальностью [3, 7, 12]. Эффективность современных способов лечения ОПН является достаточно низкой и, хотя большие надежды возлагаются, на трансплантацию печени, в экстренных ситуациях такая операция! трудно осуществима- [7, 20]. Возможность оказать стимулирующее влияние наг печень,в,критический момент позволила бы избежать многих осложнений и неприятных исходов, и, возможно, позволила бы расширить объемы резекций печени [3].

В ряде экспериментов! было показано, что источником веществ, способных улучшать состояние печени после повреждения; может служить сама; регенерирующая печень [13, 127, 132, 169]. Позже возможность восстановления, поврежденной печени под действием экстрактов (супернатантов)- из регенерирующей и неонатальной печени, а также из экстрактов сыворотки животных после резекции печени была продемонстрирована в экспериментальных работах. Однако в данных работах имелись значительные различия в подходах к получению супернатантов; оценке их действия на печень и их очистке от балластных веществ1 Источниками супернатантов служили печень. неонатальных животных, печень животных после ее резекции, а также печень животных после ее I токсического повреждения' [9, 75, 127, 147, 226, 233]. При этом в рамках каждой из работ использовался, как правило; один источник получения супернатанта, и ни в одной из работ не производили сравнения супернатантов, полученных из разных источников. Методики получения

103 супернатантов также в различной степени отличались, так как каждая группа авторов, как правило, вносила в методику свои модификации.

Изучение действия супернатантов на печень проводили на моделях с интактной печенью [13, 170, 226], с частичной деваскуляризацией печени [3, 215, 226], с резекцией печени различного объема [13, 75, 83, 106, 127, 145, 226, 233], а также с химическим повреждением печени гепатотоксинами [70, 74, .145, 157]. Эти модели часто были сложными и дорогими с позиций их пригодности для< оценки действия супернатантов на печень.

Методы оценки действия- супернатантов также сильно варьировали. В ряде работ использовали/оценку синтеза, ДНК по включению меченого тритием тимидина [57, 75, 122, 126;. 145, 226 и др.], подсчет числа митозов в печени [13, 75, 147, 156; 225-227 и др.], определение активности AJ1T и AGT в сыворотке крови [145, 227, 233], а также определение содержания холестерина и желчных кислот в; желчи [9]. Как правило, исследователи использовали: сочетание нескольких тестов, и ни в одной из работ не производили сравнение: оценочных методов с целью выбора' наиболее простого и информативного теста.

Определенная работа была проделана в сфере очистки супернатантов от балластных веществ [18; 57, 69, 75, 128, 170]. Однако единой схемы очистки выработано не было, в* связи с чем полученные в. результате очистки вещества .различались у разных исследователей. При очистке супернатантов исследователи руководствовались целью получить высокоочищенное вещество; обладающее максимальным восстанавливающим действием на печены. При этом отбирались фракции с наиболее выраженным эффектом; а фракции с менее выраженным эффектом из исследования^исключались.

Многочисленные исследованиям по- изучению* регенерации печени показали; что факторы, принимающие участие в этом процессе взаимодействуют между собой сложным образом, обеспечивая конечный результат — восстановление утраченной или поврежденной паренхимы печени [24, 64, 120, 161, 168, 172, 242]. Действие многих из факторов заключается в стимуляции синтеза ДНК. Это создает иллюзию, что многие из этих факторов дублируют друг друга и являются взаимозаменяемыми. Однако на практике можно видеть обратное — исключение какого-либо одного фактора, несмотря на различные компенсаторные механизмы, приводит к нарушению всего процесса регенерации [21, 133, 148, 153, 186, 171, 217-219; 249-251, 254]. В конечном итоге это приводит к нарушению регенерации и функциональной активности печени, и часто к смерти животного.

Данные исследований по очистке супернатантов' и. исследований; по изучению регенерации печени позволяют предположить, что1 для» восстановления печени после повреждения необходима- именно сбалансированная1 совокупность присутствующих в регенерирующей или неонатальной печени активных ингредиентов. Получение такой совокупности в составе супернатанта для дальнейшей его очистки требует -выявления оптимального источника получения достаточно большого количества супернатантов, разработки простой и- дешевой модели-повреждения печени, а также выбора быстрого и' информативного метода оценки действия супернатантов на печень.

Целью настоящей работы было улучшить состояние печени после ее обширной резекции или- токсического повреждения, при действии супернатантов, полученных из регенерирующей или неонатальной печени в эксперименте.

В работе были поставлены и решены.следующие задачи:

• разработать простую и дешевую модель повреждения* печени, удобную^ длж изучения действия супернатантов;

• определить быстрый и < информативный метод оценки действия супернатантов на поврежденную печень;

• установить оптимальный источник получения супернатантов для их последующей очистки от балластных веществ. Для решения поставленных задач было проведено несколько серий экспериментов, на крысах, мышах и поросятах. Общие данные по проведенным экспериментам представлены в таблице 45.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎