Будущее компьютерного анализа спермы

Технология компьютерного анализа спермы (Computer-aided sperm analysis, CASA) была разработана в конце 1980-х гг. для анализа характеристик подвижности и кинематики сперматозоидов и стала весьма успешной в этой области исследований. Компьютерный анализ также с большим успехом был использован при измерении таких показателей как концентрация сперматозоидов и оценка поступательной подвижности сперматозоидов у многих видов животных, а также широко применялся в лабораториях по выведению одомашненных животных и в репродуктивной токсикологии. Однако попытки использовать CASA для клинического анализа семенной жидкости человека по большому счету не принесли положительных результатов, это связано с характерными патологическими изменениями во многих образцах спермы человека, вызванных агрегацией сперматозоидов и большого количества фонового дебриса, что до настоящего времени делало невозможным получение качественного цифрового изображения для проведения анализа. Авторы статьи рассматривают усовершенствованные характеристики двух современных систем CASA (CASA-II и Microptic SCA 6) и анализируют особенности их текущего и будущего применения с определенной ссылкой на привлечение нашего внимания к использованию данной технологии, чтобы получить доступ именно к функциональным, а не простым описательным характеристикам спермия. Существуют определенные технические требования для валидации технологии CASA как полуавтоматизированной системы анализа человеческой спермы, особое внимание уделяется точности и погрешности измерений, ожидаемых от надежного медицинского лабораторного метода для применения в клинических лабораториях в соответствии с современными стандартами аккредитации.

Интерес к оценке движения сперматозоидов и к попыткам понять, что оно может сообщить нам о биологии спермы и ее функциональной компетенции, появился шесть десятилетий назад в классических работах, опубликованных Лордом Ротшильдом (Rothschild), Греем 2 (Gray), Рикменспоелем (Rikmenspoel) и их коллегами. 1-5 Тем не менее, «современная эра» кинематики сперматозоидов у высших животных, основанная первоначально на ручной оценке подвижности сперматозоидов, впервые появилась в 1970-х гг. в работе группы профессора Джорджа Дэвида (George David) в Ле-Кремлен-Бисетр (Париж, Франция) и в лаборатории Гектора Дотта (Hector Dott) в Кембридже (Великобритания), которые разрабатывали способы использования микрофотографии и микрокинематографии для количественной оценки подвижности сперматозоидов. 6-7 Дэвид Кац (David Katz) и Джим Оверстрит (Jim Overstreet) из г. Дейвис (Калифорния, США) расширили основную работу по микрокиносъемке спермы, они впервые использовали видеосъемку при анализе спермы под микроскопом, и эту методику быстро подхватили другие ученые. 10,11 Существует несколько основных обзорных статей на тему подвижности сперматозоидов высших животных и их анализа. 12-15 Основной критерий для оценки кинематики сперматозоидов (характеристики, которой описывают движение сперматозоидов, в отличие от количественного соотношения подвижных клеток), который мы используем сегодня, был сформулирован в работе группы Дэвида (George David) во время использования микрокиносъемки со скоростью 50 кадров в секунду. 7 Растущий интерес к данной области привел к появлению запутанной терминологии и определению различных кинематических критериев, но они были пересмотрены в 1988 году 16 и приняты ВОЗ в 3-м издании их руководства по лабораторному исследованию спермы в 1992 году. 17 Единое мнение, к которому пришли почти все эксперты, занятые в то время в данной области, включало трехбуквенное обозначение измеряемых параметров (например, VCL, LIN, ALH, и т.д.), а также точность предоставления результатов: измеренные параметры, такие как скорости - до 1 знака после запятой, а коэффициенты представлять целыми процентными значениями.

С появлением персонального компьютера в 1980 году, и развитием технологии оцифровки видео изображений для автоматического построения отдельных треков спермы и их анализа, произошел всплеск интереса к этой области исследований, и появились первые коммерческие CASA (компьютерный анализ спермы) системы 16: CellSoft в 1985 году, вышедшая вскоре после Hamilton-Thorn HTM-2000. В 1992 году компания Sperm Motility Quantifier (SMQ) создала одну из первых систем, позволяющих провести обычный анализ спермы при частоте кадров 50 Гц.

Так как эта область развивалась и дальше, некоторые ученые хотели перейти от использования компьютерного анализа спермы CASA в качестве исследовательского инструмента, разработанного для анализа подвижности сперматозоидов и их кинематики, к тому, чтобы использовать данную систему для автоматизированного анализа спермы человека в клинических условиях. К сожалению, из-за основных недостатков в технологии анализа изображений (в основном из-за ограниченного разрешения доступных тогда цифровых камер), эта идея была неудачной с точки зрения точности по сравнению со стандартным ручным анализом, выполненным обученными специалистами. 19,20 К этому главному недостатку системы CASA 1980-х и 1990-х годов для анализа спермы человека апеллировали на трех согласительных совещаниях: в октябре 1994 в городе Кэрнс на 7 симпозиуме по сперматологии, и в двух семинарах, проводимых Европейским сообществом по вопросам репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) в Гамбурге и Сан-Миниато, в июне 1995 года и апреле 1997 года соответственно. В доклад симпозиума в Сан-Миниато 1998 года были включены следующие рекомендации, выработанные на основе консенсуса, в отношении использования компьютерной системы CASA для анализа спермы человека:

#14. Определение концентрации спермы не должно быть основной причиной для приобретения прибора CASA

#15. Если пользователь желает использовать прибор CASA для определения концентрации спермы, то он / она должен(а) доказать, что предполагаемая техника измерений обеспечивает точные результаты по сравнению с общепринятыми, надежными методами (например, метод подсчета клеток в гемоцитометре, утвержденный ВОЗ и, возможно, метод проточной цитометрии; ВОЗ, 1992 17 )

#16. Считается, что нынешнее поколение аппаратов CASA не обеспечивает точные, воспроизводимые значения концентрации сперматозоидов, до тех пор пока система не сможет отличить сперматозоиды от других клеток и дебриса с помощью определенного метода окрашивания, например, флуоресцентной окраски ДНК с количественным определением размера ядра (Зинаман (Zinaman) и др., 1996)

#17. Определение концентрации подвижных сперматозоидов не следует рассматривать основной причиной покупки аппарата для компьютерного анализа спермы CASA

#18. При использовании в проведении повседневных анализов семенной жидкости, инструменты CASA должны быть использованы для определения концентрации прогрессивно-подвижных сперматозоидов. Компьютерный анализ CASA может определить эту величину точно, если были предприняты меры по подготовке образца, использованию инструмента, и были учтены соответствующие пользовательские критерии (Мортимер (Mortimer) и др., 1995). 21 Существующие инструменты системы CASA не должны использоваться для определения доли подвижных сперматозоидов, так как они не могут различать дебрис и мертвые сперматозоиды, и в то же время определять живые сперматозоиды.

#31.Современное поколение инструментов CASA не способно анализировать человеческую морфологию сперматозоидов в порядке, необходимом для повседненых использований в клинических условиях. В частности, неспособность включить анализ шейки и хвоста сперматозоида (как этого требуют рекомендации ВОЗ) считается основным недостатком. Следовательно, использование инструментов CASA для клинической оценки морфологии спермы человека в настоящее время не поддерживается (ВОЗ, 1992).

Следует подчеркнуть, что эти пункты соглашения отражают ситуацию в 1998 году, - но, если система компьютерного анализа спермы CASA не задействует в работе значительно улучшенную технологию и / или программное обеспечение, то те же затруднения и недостатки будут иметь место и сегодня. Почти через 20 лет после встречи в городе Кэрнс, полагали, что будет целесобразным в 12-й Симпозиум по вопросам сперматологии 2014 года включить семинар по нынешним и будущим возможностям технологий CASA, основываясь на личном опыте авторов двух систем CASA «следующего поколения», которые включают в себя улучшенные возможности.

Основополагающие стандарты для всех медицинских лабораторий являются общеприменимыми и четко определены в ISO 15189:2007. Как и для любого медицинского лабораторного теста, результаты анализа спермы должны быть точными, чтобы иметь практическую ценность. 25,26 Любой количественный результат должен быть в пределах допустимого диапазона «правильных ответов», т.е. его погрешность измерения (UoM) по отношению к установленным стандартам или порядкам: «Эксперт» лаборатории андрологии и репродукции человека должен безоговорочно добиться погрешности измерений (UOM) ± 10% 26 . Что касается любого медицинского лабораторного анализа, внутренний контроль качества (IQC) и внешний контроль качества (EQC) являются обязательными. 26,27 Тем не менее, для того, чтобы схема EQC имела практическую ценность, она должна включать в себя возможность повышения качества. Лаборатории должно быть известно, насколько близки результаты по отношению к правильным значениям для того, чтобы иметь возможность провести необходимые тренинги и тем самым улучшить результаты, если они находятся за пределами допустимого диапазона погрешности.

Таким образом, результаты анализа характеристик спермы, полученные с помощью компьютерной системы CASA в клинической андрологической лаборатории должны быть в пределах ± 10% от контрольных значений для экспертной андрологической лаборатории (хотя и ± 20% могут быть приемлемы для обычной клинико- диагностической лаборатории). Здесь предполагается, что все клинические андрологические лаборатории соответствуют текущей принятой методологии анализа спермы «Золотой стандарт», определенной в нормативах Всемирной организации здравоохранения 28 , или в рекомендациях рабочей группы по проблемам андрологии в составе Европейского Общества по вопросам репродукции человека и эмбриологии26, а также считается, что все сотрудники лаборатории должны быть хорошо обучены, согласно протоколам и системам контроля качества. К сожалению, через 34 года после публикации первого лабораторного руководства ВОЗ для анализа спермы, это по-прежнему остается главным недостатком большинства андрологических лабораторий по всему миру. Последняя инспекционная проверка 40 клинико-андрологических лабораторий в 22 странах 3 года назад показала, что более 90% из них либо имеют несоответствия в плане правильного использования микроскопа, контроля температуры, общей стандартизации, аналитического контроля качества, либо неправильно выполняют технические инструкции ВОЗ.29 Недостаточное соответствие международным техническим инструкциям хорошо известно 30,31 , и, кажется, что это соответствие на особенно низком уровне в центрах искусственного оплодотворения, данные проверки, проведенные за последние 15 лет показали, что только 1 из 47 центров в 14 странах существенно соответствовали установленным стандартам для их андрологических лабораторных услуг.

При использовании компьютерной системы CASA существует также проблема обеспечения фиксированной толщины образца, которая должна быть сделана для анализа в приборе, и что толщина действительно не может превышать 20 мкм для надежного отслеживания сперматозоидов под микроскопом с объективом 10х. Хотя на рынке существует множество счетных камер для анализа спермы, все устройства с фиксированным покровным стеклом требуют наполнения под воздействием капиллярной силы и, следовательно, будут подвергаться эффекту Сегре-Зильберберга, что влияет на измеренную во время анализа концентрацию сперматозоидов в результате артефактов ламинарного потока, в результате чего, в зависимости от вязкости, будет иметь место недооценка концентрации на величину, достигающую 30% при нормальной вязкости. 33,34 Тем не менее, счетные камеры, такие как 2X-CEL и Cell-VU, которые используют отдельное покровное стекло над каплями суспензии сперматозоидов («дроп-загрузку») не подвергаются воздействию этой ошибки. Следовательно, если бы CASA система использовалась для сравнения результатов оценки концентрации спермы, полученных с использованием капиллярных счетных камер с референсными значениями, полученными с помощью гематоцитометра, то это бы установило, что компьютерный анализ спермы CASA на самом деле имел изменчивую переоценку реальных значений, и, следовательно, результаты анализа были бы недостоверными.

Тщательное исследование, сравнивающее счетную камеру Маклера (10 мкм) и одноразовые счетные камеры фирмы Leja 20 мкм c гемоцитометром Нейбауэра показало, что камера Маклера является крайне неточной в определении концентрации сперматозоидов - как правило, она дает значительно завышенные значения, а счетная камера Leja может достичь сопоставимой с гемоцитометром точности, что позволяет использовать ее в клинических условиях. 31 Тем не менее, эта эквивалентность была достигнута только путем определения времени, необходимого для капиллярного наполнения камеры и применения соответствующего поправочного коэффициента для эффекта Сегре-Зильберберга 33,34 и предварительного разбавления спермы: ни один из этих этапов не осуществляется во время использования данной счетной камеры в обычной клинико-лабораторной практике. Кроме того, всегда будет оставаться вопрос о надежности образцов, даже полностью сжиженных и хорошо смешанных человеческих эякулятов при аликвотировании только 4 или 5 мкл, требуемых для наполнения камеры для анализа при помощи CASA.

Также следует подчеркнуть, что сравнение между системами не может быть основано на средних значениях или на корреляциях / линейной регрессии между парными значениями: оба метода скрывают реальные различия, которые существуют между конкретными повторными исследованиями. Вместо этого должны быть использованы графики Бланда-Альтмана «Пределы согласия» или «отклонения от заданного значения», которые показывают фактическую разницу между парными значениями, и, следовательно, могут быть использованы для определения того, находится ли точность каждого «нового метода» (или «специалиста») в пределах ± 10% от эталонного метода анализа. Это сравнительная техника «золотого стандарта», и отчеты, использующие другие статистические подходы, многие из которых, как правило, скрывают истинные масштабы существующего несоответствия, следует рассматривать с осторожностью. На самом деле, результат анализа графика Бланда и Альтмана всегда может быть основан на случайности, и эта возможность должна быть исключена с применением регрессионного анализа Passing и Bablok, используя, например, MedCalc (см. www.medcalc.be). Другим дополнением к анализу Бланда и Альтмана является регрессионный метод Деминга (также доступны в MedCalc), который предоставляет данные в установлении соответствия между разными методами, испытанными на дубликате, а также дает коэффициент отклонения.

Технология CASA широко используется с отличными результатами в лабораториях по выведению разных видов домашних и диких животных, однако сложно сказать то же самое применимо к клиническим лабораториям, где исследуют сперму человека. Те, кто использует его для этой цели (предположительно) считают, что его результаты являются более надежными, чем те, что может получить недостаточно обученный персонал, проводящий анализ спермы, и / или их низкая стоимость исследования не позволят проводить более точные испытания. Тем не менее, следует отметить, что, начиная с момента использования, система CASA очень хорошо работала на некотором количестве промытой человеческой спермы, которая, как правило, имеет очень высокую подвижность сперматозоидов и минимальное загрязнение при распаде клеток и появления дебриса. Ограничения, влияющие на способность CASA предоставлять точные результаты концентрации спермы и процент подвижных или постепенно подвижных сперматозоидов, делятся на две основные категории: биологические (Табл 1) и технические.