научная статья по теме ЭНЕРГИЗАЦИЯ МЕМБРАН ИЗ BACILLUS SUBTILIS ПОВЫШАЕТ КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ СУКЦИНАТ:МЕНАХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ Химия

Текст научной статьи на тему «ЭНЕРГИЗАЦИЯ МЕМБРАН ИЗ BACILLUS SUBTILIS ПОВЫШАЕТ КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ СУКЦИНАТ:МЕНАХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ»

БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып.. 1, с. 63 - 77

ЭНЕРГИЗАЦИЯ МЕМБРАН ИЗ Bacillus subtilis ПОВЫШАЕТ КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ СУКЦИНАТ:МЕНАХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ*

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: +7(495)939-3181, электронная почта: konst@genebee.msu.su

Поступила в редакцию 21.05.09 После доработки 23.06.09

Впервые продемонстрирована А^Н+-зависимая сукцинатоксидазная активность в мембранных частицах Bacillus subtilis. Установлено, что максимальная скорость дыхания от сукцината вывернутых суббактериальных частиц из штамма с повышенной продукцией сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы в условиях сопряжения приближается к скорости дыхания целых клеток. Отмечено, что деэнергизация мембраны частиц ионофорами или аламетицином практически полностью подавляет окисление сукцината. Обнаружено, что кажущееся значение константы Михаэлиса по сукцинату для сукцинатоксидазной активности частиц (2,2 мМ) возрастает на порядок по сравнению с таковым для энергонезависимой реакции восстановления дихлорфе-нолиндофенола. Полученные результаты свидетельствуют о критической роли А^Н+ в переносе электронов сукцинат:менахинон-оксидоредуктазой. Эта роль может быть связана либо с использованием энергии А^Н+ для трансмембранного переноса зарядов по электрическому полю в ходе термодинамически невыгодного восстановления менахинона, либо с поддержанием электронейтрально работающего фермента в активной конформации.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сукцинат:менахинон-оксидоредуктаза, А^Н+, Bacillus subtilis, электрогенез, менахи-нон, фумарат.

Сукцинат:менахинон-оксидоредуктаза Bacillus subtilis относится к группе ферментов, катализирующих двухэлектронное восстановление мембранного хинона сукцинатом (сукцинат:хинон-оксидоредуктазы (SQR)) [1]. Родственную с SQR группу составляют ферменты сходной структуры, катализирующие in vivo обратный процесс (хинол:фумарат-оксидоредуктазы (QFR)) [2]. Функции SQR и QFR, по-видимому, никогда не реализуются одновременно (первая характерна для аэробного метаболизма, вторая — для анаэробного [3]); при данных условиях в клетке обычно экспрессируется лишь один тип фер-

Принятые сокращения: SQR — сукцинат:хинон-ок-сидоредуктаза, QFR — хинол:фумарат-оксидоредуктаза, MQ — менахинон, MQH2 — менахинол, MQ7 -менахинон-7, MQ7H2 — менахинол-7, FAD — флавинадениндинуклеотид, ФМС — феназинметасульфат, ДХФИФ — 2,6-дихлорфенол-индофенол, ДЦКД — N, N'-дициклогексилкарбодиимид, NADH — никотинамидадениндинуклеотид, ТМФД — N, N, N', N'-тетраметил-я-фенилендиамин, КЦХФ — карбо-нилцианид-ж-хлорофенилгидразон.

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 09-162, 20.12.2009.

** Адресат для корреспонденции.

мента [4]. Тем не менее каждый из представителей семейства SQR/QFR может достаточно эффективно работать в обоих направлениях [5, 6]. Направление процесса определяется разностью редокс-потенциалов между донором и акцептором электронов [5].

По устройству мембранной части ферменты семейства подразделяют на типы А—Е [7]. SQR из B. subtilis, единственная мембранная субъединица которой содержит две гемовые группы (схема), принадлежит согласно этой классификации к типу В [8]. Гексакоординированные низкоспиновые гемы b с имидазолами гистиди-нов в качестве аксиальных лигандов расположены один под другим, причем их плоскости перпендикулярны как друг другу, так и плоскости мембраны [9]. Значения Em7 двух гемов равны +65 и —95 мВ [8, 10]. Высокопотенциальный гем bH расположен ближе к цитоплазматическим субъединицам фермента, содержащим FAD и железосерные редокс-центры, низкопотенциальный гем bL — ближе к периплазматической поверхности белка [11]. Восстановление хинона осуществляется вблизи гема bL [12], т.е. у внешней стороны клеточной мембраны. К типу В относится также QFR из Wolinella succinogenes, для

Сукцинат:менахинон-оксидоредуктаза B. subtilis. Редокс-группы фермента: ковалентно связанная молекула FAD (после двухэлектронного восстановления FADH2), три же-лезосерных кластера (ромбы) и два гема типа b. Точечные стрелки — направление транспорта электронов, сплошные полукруглые стрелки — двухэлектронные реакции окисления сукцината и восстановления MQ7, вертикальная черта — место действия ингибитора HOQNO

которой определена трехмерная структура с разрешением 2,2 А [13].

Наличие второго гема, расположенного у наружной поверхности мембраны, характерно для менахинонсодержащих организмов (как правило, анаэробов), у которых рассматриваемый фермент действует как фумаратредуктаза. Почти строгий аэроб В. ячЬННя является в этом смысле исключением: его двугемовая работает в

«прямом» направлении, передавая в дыхательную цепь электроны от сукцината к хинонному пулу, представленному менахиноном Мр7 [14]. Перенос электронов с пары сукцинат/фумарат (Ет7 = +24 мВ [15]) на пару Мр7Н2/Мр7 (Ет7 = = —74 мВ [16]), очевидно, термодинамически не выгоден, и полной ясности в том, как решается эта проблема, пока нет.

Достоверно установлено необычное обстоятельство: в отличие от большинства бактерий и от митохондрий дыхание клеток В. ячЬННя не стимулируется разобщителями окислительного фосфорилирования (отсутствует так называе-

мый эффект дыхательного контроля [17, 18]), а подавляется ими [19—22]. Когда электроны поступают в дыхательную цепь от сукцината, данное явление можно объяснить необходимостью потребления энергии в форме протондвижущей силы в ходе сукцинат:менахинонредуктазного процесса. Это согласуется с распространенным представлением о том, что термодинамический барьер сукцинат:менахинонредуктазной реакции преодолевается за счет А^И+, создаваемой на мембране В. ячЬИШ другими звеньями дыхательной цепи [20, 23—25].

В пользу такой гипотезы имеется ряд свидетельств. В частности, на встроенной в липосомы из В. ¡¡скеп1/огт1з, сходной с ферментом из В. ячЬИНя, было продемонстрировано, что и сук-цинат:хинонредуктазная, и хинол:фумаратре-дуктазная реакции могут сопровождаться образованием А^Н+ соответствующей полярности, правда, лишь в том случае, когда разница между потенциалами полувосстановления донора и акцептора (искусственного аналога менахинона) электронов достаточно велика [26]. В то же время в экспериментах со встроенной в липосомы из менахиноносодержащей термофильной бактерии ШойоШетчя таппчя влияния мембранного потенциала на внутримолекулярный перенос электронов обнаружить не удалось [27].

С моделью, в которой хинол:фумаратредук-тазная реакция может быть сопряжена с образованием А^Н+, согласуются и данные о трехмерной структуре РБЯ из Ж. sчccinogenes [13, 28, 29]. Два гема Ь расположены трансмембранно, а место связывания менахинола граничит с полостью, открывающейся в периплазматическое пространство. Освобождающиеся при окислении менахинола протоны должны поступать во внешнюю среду, а электроны должны пересекать мембрану в направлении снаружи внутрь, создавая разность электрических потенциалов. Тем не менее опыты на клетках, суббактериальных частицах и протеолипосомах, содержащих РБЯ из Ж. sчccinogenes, убедительно доказали электронейтральность фумаратредуктазной активности этого фермента [30, 31].

Для согласования структурных и экспериментальных данных была предложена гипотеза так называемого Е-пути (Е обозначает остаток глутамата) [32], согласно которой электрогенный перенос поперек мембраны двух электронов в РБЯ из Ж sчccinogenes компенсируется переносом по белку в том же направлении двух протонов [33]. Ключевую роль в гипотетическом переносе протонов играет, по мнению авторов гипотезы, остаток Е180. Результаты мутагенеза подтвердили необходимость Е180 для хи-нол:фумаратредуктазной активности фермента

и влияние замен остатка на потенциал полувосстановления гема bH [34]. Более того, после замены глутамата 180 на глутамин встроенная в липосомы QFR из W. succinogenes приобрела способность генерировать Л^Н+ при восстановлении фумарата, правда, лишь в присутствии искусственных доноров электронов с потенциалом полувосстановления существенно более низким (Ет7--170 мВ), чем у MQ7H2 [35].

Таким образом, молекулярный механизм, с помощью которого представители семейства SQR/QFR типа В осуществляют в природной мембране восстановление менахинона сукцина-том и в обратной реакции окисление менахино-ла фумаратом, представляет большой интерес, но далек от ясности и требует дальнейших исследований. Жесткое сопряжение в этих ферментах переноса электронов с расходованием либо генерацией Л^Н+ убедительного подтверждения пока не находит. Следует отметить, что хорошо документированная зависимость сукци-натоксидазной [20, 24, 25] и сукцинат:хинонре-дуктазной [22, 24] активностей SQR в целых клетках B. subtilis от энергизации мембраны может объясняться и кинетическими причинами: Л^Н+ на сопрягающей мембране могла бы стимулировать работу фермента, поддерживая его активную конформацию.

До последнего времени ингибирование сук-цинатного дыхания B. subtilis, вызываемое де-энергизацией мембраны, удавалось регистрировать лишь на целых клетках [20, 24, 25], что существенно ограничивало возможности экспериментального подхода к изучению эффекта. В представленной работе впервые подобраны условия, позволяющие наблюдать и исследовать энергозависимую сукцинатоксидазную активность вывернутых мембранных частиц.

Реактивы. В основном использовались реактивы отечественного производства степени очистки х.ч. или ос.ч. Кроме того, применялись следующие импортные продукты высокой степени очистки: дрожжевой экстракт («Difco», США), феназинметасульфат (ФМС) («Serva», Германия), аламетицин и акридиновый оранжевый («Merck», Германия), валиномицин («Fluka», США), NADH (ICN, США), додецилмальтозид, фенилметилсульфонил фторид, N, N'-дицикло-гексилкарбодиимид (ДЦКД), N, N, N', N'-тет-раметил-«-фенилендиамин (ТМФД), менадион (витамин К3), ДНКаза I, D,T-диафораза, карбо-нилцианид-ж-хлорофенилгидразон (КЦХФ), моненсин и нигерицин («Sigma», США).

Препарат SQR, выделенной из B. subtilis, был любезно пред

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎