Исследование терморезистентности и антагонистических свойств дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Использование антагонистических свойств одних бактерий для ингибирования других (патогенных) изучались на протяжении многих лет, в то время как мало внимания было уделено исследованию таких свойств у дрожжей.

Установлено, что действие метаболитов дрожжей и дрожжевых клеток на грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы разное: живые клетки дрожжей наиболее антагонистически активны против грамположительных микроорганизмов, а их метаболиты — по отношению к грамнегативним.

Ключевые слова: S. cerevisiae, хлеб, антагонизм, киллерные токсины

Using antagonistic properties of some bacteria to inhibit other (pathogenic) has been studied for many years, while little attention was paid to study such properties in yeast. The yeast metabolites and yeast cells action on gram-negative and gram-positive microorganisms was different. Live yeast cells were the most antagonistically active against gram-positive microorganisms and their metabolites - in relation to gram-negative.

Keywords: S. сerevisiae, bread, antagonism, killer toxins

В основе формирования качества хлеба лежит совокупность сложных преобразований сырья под действием микроорганизмов и ферментов, которые либо уже присутствуют в перерабатываемых рецептурных компонентах, или специально использованы в технологическом процессе. То есть качество хлебобулочных изделий зависит от хлебопекарных свойств муки, дрожжей, другого сырья, состояния и изменения их углеводно-амилазного, белково-протеинового и липидно-липазных комплексов в ходе технологического процесса, а также жизнедеятельности микроорганизмов [1].

В последнее время тенденция увеличения поставок муки с низкими хлебопекарными свойствами существенно увеличилась. Хлебозаводы и пекарни вынуждены перерабатывать пшеничную муку, химический состав и качество которой колеблется в разных партиях. Это влияет, в первую очередь, на свойства хлебопекарных полуфабрикатов, интенсивность протекания коллоидных, биохимических и микробиологических процессов при изготовлении теста и его разделении, и в конечном итоге, на показатели качества готовых изделий [1, 5].

Изучение и возможность применения антибактериальных соединений, которые выделяются дрожжами, находятся на ранней стадии развития. Антагонизм дрожжей по отношению к различным микроорганизмам связан в первую очередь с борьбой за питательные вещества в среде обитания. Он проявляется за счет изменения рН среды в результате ионного обмена или синтеза органических кислот, производства высоких концентраций этанола, выделение антибактериальных соединений и киллерных токсинов. Открытие антангонистических свойств дрожжей находит широкое применение во многих отраслях, таких как пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина, ветеринария, охрана окружающей среды [6, 10].

Считается, что гибель дрожжей начинается уже при 45—50° С, а при 90—95° С они полностью погибают. Однако согласно последним литературным данным, клетки сахаромицетов при таких температурах не полностью погибают, а лишь получают сублетальные повреждения и теряют способность к росту на питательных средах. Поэтому истинное количество клеток в пищевом продукте может быть недооценено [8].

Исследование терморезистентности и антагонистической активности дрожжей S. cerevisiae и их метаболитов по отношению к различным группам микроорганизмов.

Исследование антагонистических свойств метаболитов дрожжей проводили, используя следующие образцы хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae:

- прессованные дрожжи ТМ «Львовские дрожжи»;

- прессованные дрожжи ТМ «Криворожские дрожжи»;

- сухие активные дрожжи ТМ «Саф-Левюр»;

- дрожжи, выделенные из хлеба, испеченного в лабораторных условиях с содержанием дрожжей 2, 4 % по рецептуре;

- дрожжи, выделенные из хлеба на хмелевой закваске;

- дрожжи, выделенные из батона «Нива», с содержанием дрожжей 1, 5 % по рецептуре;

- дрожжи, выделенные из батона «Киевский», с содержанием дрожжей 3 % по рецептуре;

- дрожжи, выделенные из хлеба зернового «Молодость», который испечен на зерновой закваске без дрожжей.

Для определения способности клеток дрожжей выживать при температуре выпекания хлеба использовали: хлеб с содержанием 2, 4 % прессованных и 0, 8 % сухих дрожжей, мякиш которого вносили в солодовый экстракт с и без добавления NaCl, хлеб с содержанием 1 %, 5 % и 3 % дрожжей, мякиш которого вносили в горькую заварку.

Замес теста и формование изделий лабораторных образцов проводили вручную. Температура выпекания 200—220° С, время выпекания 40—45 мин.

Для определения количества живых дрожжевых клеток в хлебе из торговой сети использовали следующие образцы:

- ржаной бездрожжевой цельнозерновой хлеб ТМ «Милльвиль»;

- хлеб ржаной бездрожжевой на хмеле ТМ «Ржаная сила».

Для определения антагонистических свойств дрожжей, их метаболитов, полуфабрикатов и хлеба использовали следующие тест-культуры музея кафедры биотехнологии и микробиологии: Staphylococcus aureus БМС-1, Escherichia coli ИЭМ-1, Bacillus subtilis БТ-2, Enterobacter cloacae БТ-4, Penicillium chrysogenum Ф-7, Aspergillus niger Р-3.

Методы микробиологических исследований

Для выявления антагонистических свойств дрожжей по образованию зон задержек роста тест-культур использовали метод перпендикулярных штрихов и метод бумажных дисков [2].

Метод перпендикулярных штрихов. Среды (сусло-агар, Сабуро, ГКА, пептон-глюкозный дрожжевой агар) разливали в чашки Петри и инкубировали сутки в термостате для проверки микробиологической чистоты сред. По всей длине чашки высевали сплошной линией один из исследуемых образцов дрожжей. Штрихом, перпендикулярно к линии роста дрожжей, начиная от периферии чашки, подсевали тест-культуры. Чашки Петри выращивали в термостате при 30° С в течение 3 сут. Тест-культуры (S. aureus, E. coli, B. subtilis, E. cloacae) использовали односуточные [2].

Метод бумажных дисков. Производственные расы хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae в количестве 3 % вносили в колбы на 750 мл с 150 мл стерильной питательной среды (NaCl 0,5 %, глюкоза 5 % на 1 л воды). Культивирование проводили в течение 48 ч на качалках (320 об/мин) при 30°С. Пробы центрифугировали для получения надосадочной (активные метаболиты) и осадочной фракции (клетки дрожжей) [2].

Тест-культуры высевали сплошным газоном на среду Сабуро. Затем поверх посева устанавливали стерильные диски фильтровальной бумаги, смоченные в биологические пробы (надосадочную и осадочной жидкости). Инкубировали при 37 С двое суток при комнатной температуре. После этого проводили измерения диаметра задержки роста тест-культур.

Восстановление сублетально поврежденных клеток дрожжей. Опытные образцы хлеба разрезали пополам и вынимали мякоть весом 10 г. Половину мякоти вносили в 45 мл солодового бульона, а другую — в солодовый бульон с добавлением NaCl. Культивирование проводили в течение 24 ч при температуре 30° С. Пробы отбирали на 4, 18 и 24 ч культивирования в количестве 1 мл с последующим посевом глубинным способом на среды сусло-агар и солодовый агар. Среды содержали антибиотик стрептомицин. Чашки Петри помещали в термостат и выдерживали при температуре 30°С, подсчет восстановленных клеток дрожжей проводили через 3 сут. [1].

В случае, если микроорганизмы подвергаются экологическим стрессам, таким как действие высокой или низкой температуры, то отдельные клетки получают метаболические повреждения и, как следствие, становятся неспособными формировать колонии на селективных питательных средах. В то же время не поврежденные клетки могут быть толерантными. Поэтому для восстановления поврежденных клеток используют специальные восстанавливающие среды [9].

Сублетально поврежденным микроорганизмам присущи задержки в стадиях роста, повышенная чувствительность к различным агентам селективной питательной среды, повреждения мембран, ДНК и ферментов цикла трикарбоновых кислот, разрушение рибосом. Повреждение рибосом и клеточных мембран проявляется как обычное следствие повреждения высокой температурой [7, 10].

Поэтому на первом этапе работы по исследованию способности дрожжевых клеток выживать при температуре выпекания хлеба использовали горькую заварку (с добавлением 1 % хмелевого отвара), в которую вносили мякиш опытных образцов хлеба, выпеченных с добавлением 1, 5 % и 3 % дрожжей и без них. Заварка служила питательной средой для сублетально поврежденных клеток.

Следует указать, что при проведении микробиологического анализа заварок и хлеба перед началом опыта, дрожжевых клеток в них не обнаружили.

В ходе эксперимента было установлено, что после 24 ч брожения заварка с внесением мякиша из бездрожжевого хлеба не содержит жизнеспособных клеток дрожжей. Она имеет приятный медовый запах, признаки брожения и контаминации отсутствуют.

В заварке с хлебом, который выпечен с добавлением 1, 5 % и 3 % дрожжей к массе муки, их количество составляло 1 × 10 2 и 1 × 10 3 КОЕ / г соответственно. В первом образце отмечено появление неприятного гнилостного запаха и посторонних микроорганизмов, незначительное увеличение в объеме, что свидетельствует о начале брожения. Второй образец имел спиртовой запах, а объем заварки в результате брожения увеличился вдвое.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности клеток дрожжей оставаться жизнеспособными в хлебе после воздействия на них высоких температур выпекания.

Следующим этапом работы по восстановлению сублетально поврежденных клеток дрожжей стало использование в качестве восстанавливающей среды солодового экстракта, в который вносили мякиш хлеба с последующим выдерживанием в нем в течение 3 ч. Затем 0, 2 мл исследуемой суспензии высевали на питательную среду сусло-агар. В качестве образцов использовали хлеб, выпеченный с добавлением 1, 5 и 3 % прессованных дрожжей к массе муки.

Установлено, что в мякоти обоих образцов хлеба содержится 1—2 КОЕ/г дрожжей. Анализируя полученные результаты, было сделано предположение, что время выдержки опытных образцов хлеба в солодовом экстракте не является достаточным для восстановления сублетально поврежденных клеток дрожжей. Поэтому было увеличена продолжительность выдержки мякиша опытных образцов хлеба до 24 ч с последующим отбором проб через 4 и 18 ч.

Через 4 ч выдержки хлеба в солодовом экстракте, роста клеток дрожжей на сусло-агаре не обнаружено. Анализ результатов исследования образцов через 18 ч показал, что после высева 1 мл суспензии с первого образца хлеба, изготовленного с добавлением 1, 5 % дрожжей на сусло-агаре выросло 2—4 КОЕ, а со второго (хлеб, испечённый с добавлением 3 % дрожжей) — 6—8 КОЕ. Микробиологический контроль исследуемых объектов через 24 ч культивирования показал, что количество дрожжей на чашках Петри составляло соответственно 3—5 КОЕ и 8—9 КОЕ.

Для проверки терморезистентности дрожжей, кроме хлеба, выпечённого в лабораторных условиях, были использованы образцы хлеба, приобретенные в торговой сети (рисунок 1.).

Рисунок 1 — Содержание дрожжей в хлебе из торговой сети

Анализ исследований показал, что наибольшее количество живых клеток дрожжей было обнаружено в батоне «Киевский», с содержанием прессованных дрожжей 3 % по рецептуре, испечённого безопарным способом. Наименьшее количество — в хлебе, изготовленного на хмелевой закваске. Хлеб использовали сразу после приготовления.

Следует отметить, что проведенные исследования содержания дрожжей в хлебе промышленного производства через 24 и 48 ч хранения жизнеспособных клеток дрожжей не обнаружили.

При микроскопировании выделенных образцов дрожжей, которые выросли на сусло-агаре обнаружено, что они имеют значительно меньшие размеры, чем обычные сахаромицеты (рисунок 2.)

Рисунок 2 — Сравнение размеров выделенных дрожжей: 1 — дрожжи, которые обнаружены в батоне «Нива», 2 — дрожжи, которые обнаружены в батоне «Киевский», 3 — Saccharomyces cerevisiae

Дрожжи, выделенные из хлеба на хмеле, отличались по своим культуральным признакам, поскольку их колонии были не белого, а кремового цвета, а клетки под микроскопом имели достаточно большие размеры (рисунок 3).

Рисунок 3 — Дрожжи, выделенные из хлеба на хмелевой закваске

Проведенные исследования по определению видовой принадлежности, по морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим признакам по сбраживанию углеводов подтвердили, что все дрожжи, выделенные из различных образцов хлеба, относятся к S. cerevisiae (таблица 1)

Таблица 1 — Сбраживание углеводов выделенными дрожжами

Углеводы S.cerevisiae В батоне «Нива» В батоне «Киевский» В хмелевом хлебе 1 Глюкоза +++ + + + 2 Фруктоза +++ ++ +++ + 3 Манит -/+ - + - 4 Галактоза +/- + - - 5 Ксилоза - - - - 6 Арабиноза -/+ - +- - 7 Мальтоза +/- + +- +- 8 Лактоза - - - - 9 Сахароза +++ ++ ++ + 10 Раффиноза + + - + 11 Дульцин - - - - 12 Сорбит -/+ - - - 13 Этиловый спирт - - - - 14 Глицерин -/+ - - -

Для подавления роста бактерий и лучшего восстановления дрожжей в солодовый экстракт предложено вносить соль в количестве 10 % от общего объема. В качестве опытных образцов использовали хлеб, выпеченный в лабораторных условиях с добавлением 2, 4 % прессованных и 0, 8 % сухих дрожжей.

Как известно NaCl используют в качестве пищевого консерванта. Соль способна ингибировать рост бактерий: сначала клетка подвергается плазмолизу, что подавляет ее рост, а потом и вовсе погибает. Ингибирующий эффект соли не зависит от значения рН. Большинство не морских бактерий погибает при 20 % или даже меньшей концентрацией NaCl, тогда как плесневые грибы и дрожжи переносят высокую концентрацию, которая в некоторых случаях является стимулятором роста клеток [2, 4]. Соль оказывает защитное влияние на эти микроорганизмы, вследствие снижения активности воды (аw) и повышения термостойкости микроорганизмов по механизму, который аналогичен высушиванию.

В опыте по выявлению живых клеток дрожжей в качестве образца использовали хлеб, выпеченный с добавлением 2, 4 % прессованных дрожжей, с последующим выдерживанием его 1, 5 часа в солодовом экстракте с добавлением соли. На чашке Петри были выделены 14 КОЕ дрожжей. Колонии изолированных клеток дрожжей были окрашены в розовый цвет, имели ровную поверхность, правильные края (рисунок 4).

Рисунок 4 — Колонии дрожжей, выделенных из хлеба выпеченого в лабораторных условиях

Следует отметить тот факт, что восстановление поврежденных клеток дрожжей, которые выдерживались в солодовом экстракте с добавлением соли, началось в 2 раза быстрее, нежели без внесения NaCl.

В хлебе, испечённом с добавлением 0, 8 % сухих дрожжей от массы муки, клеток дрожжей выделено не было. Вероятно, это связано с небольшим процентом дрожжей в хлебе.

Чтобы проверить способность дрожжевых клеток выживать при температуре выпекания хлеба, и как следствие их термостойкость, были выбраны следующие образцы хлеба, приобретенные в торговой сети:

- ржаной бездрожжевой цельнозерновой хлеб ТМ «Милльвиль»;

- хлеб ржаной бездрожжевой на хмелю ТМ «Ржаная сила».

В ходе эксперимента сублетально поврежденных клеток дрожжей выделено не было. Дрожжи в данных образцах оказались не устойчивыми к высоким температурам выпекания.

На следующем этапе роботы были исследованы антагонистические свойства дрожжей S. cerevisiaе и их метаболитов в отношении различных тест-культур методом бумажных дисков на среде Сабуро (рисунок 5).

Рисунок 5 — Зоны задержек роста тест-культур: 1 — В. subtilis; 2 — E. сloaceae

В качестве объектов исследований были выбраны прессованные дрожжи торговых марок «Криворожские дрожжи» ООО «Лесаффр Украина» и «Львовские дрожжи» ЗАО «Компания Энзим», сухие активные дрожжи ТМ «Саф-ЛЕВЮР» и дрожжи, которые выделили из хмелевого хлеба.

Образцы дрожжей культивировали в среде с глюкозой и NaCl в течение 48 ч. Пробы отбирали на 6, 24 и 48 ч культивирования (таблица 2.).

Таблица 2 — Значение рН исследованных проб суспензии дрожжей