Гибридизация нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты

Специфические характеристики любого организма зависят от определенной последо­вательности нуклеиновых кислот, содержащихся в его геноме.

Сами нуклеиновые кис­лоты состоят из цепей блоков, каждый из которых состоит из сахара (дезоксирибоза или рибоза, в зависимости от того, является ли нуклеиновая кислота ДНК или РНК), фосфоросодержащей группы и одного из четырех органических пуриновых или пири­мидиновых оснований. ДНК состоит из двух таких цепочек, расположенных в виде двойной спирали и соединенных между собой связями между органическими основа­ниями. Основания избирательно связывают аденин с тимином и гуанин с цитозином. Именно последовательность оснований делает организмы уникальными.

Разработка зондов (проб) на основе нуклеиновых кислот

Зонды на основе нуклеиновых кислот — это небольшие сегменты однонитевой нуклеи­новой кислоты, которая может быть использована для определения специфических генетических последовательностей в пробах. Зонды (пробы) могут разработаны для последовательностей ДНК или РНК. Привлекательность использования генных зон­дов в определении микроорганизмов заключается в том, что зонд, состоящий из пос­ледовательности лишь 20 нуклеотидов, уникален и может быть использован для точ­ного определения микроорганизма [52].

Чтобы обнаружить связывание зонда с ДНК или РНК определяемого микроорга­низма, он должен быть присоединен к какой-либо метке, которую легко выявить. Сначала работа выполнялась с радиоизотопными метками (например, на основе ра­диоактивного фосфора Р32), который мог быть определен авторадиографией или подсчетом сцинцилляций. Использование и утилизация радиоактивных изотопов, однако, неизбежно сопряжены с проблемами безопасности, что делает их непригод­ными для стандартных испытаний в лабораториях пищевых производств. Поэтому для широкого применения зондов на основе нуклеиновых кислот требовались иные метки.

Значительный объем исследований был посвящен мечению зондов с использова­нием связи «авидин-биотин». В основе этого приема лежит высокая специфичность связи между авидином и биотином. Зондовая последовательность нуклеиновой кис­лоты метится биотином и взаимодействует с определяемой ДНК. Затем добавляется авидин, связанный с подходящим индикатором, например, авидин-щелочной фосфатазой, и связывание затем обнаруживается по образованию окрашенного продукта в бесцветном субстрате. Применение таких новых систем мечения показало, что зонды с нерадиоактивными метками могут быть использованы для определения микроорга­низмов, но они гораздо менее чувствительны, чем системы с радиоизотопным мечением, и требуемое для определения увеличение количества клеток (по сравнению с радиоизотопной системой) доходит до 100-кратного.

Для создания неизотопных зондов с чувствительностью, приближающейся к чув­ствительности изотопных меток, было необходимо изучить в клетках альтернативные мишени для зондов. Зонды, ориентированные на клетки ДНК, прикрепляются только к нескольким участкам на хромосоме клетки определямого микроорганизма. Изучая области клеточной нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в относительно боль­шом количестве копий в каждой клетке, и ориентируя зонды на эти участки, можно значительно увеличить чувствительность неизотопных зондов. Работа по увеличению чувствительности зондов сосредоточилась на использовании в качестве мишени РНК. РНК — это однонитевая нуклеиновая кислота, которая присутствует в клетках в раз­ных формах. В одной из форм она обнаруживается в рибосомах, которые являются частью системы синтеза белка в клетке. Такая РНК (известная как рибосомная РНК — рРНК) присутствует в клетках в большом количестве копий. Ориентируя зонды из нуклеиновых кислот на рибосомную РНК, можно существенно увеличить чувстви­тельность аналитической системы.

Пробы на микроорганизмы в пищевых продуктах

Процедуры гибридизации нуклеиновых кислот для определения патогенных бактерий в пищевых продуктах описаны для разновидностей Salmonella [35,47], Listeria [73,74], Yersinia enterocolitica [56,66], Listeria monocytogenes [38], вырабатывающей энтероток­сины Escherichia coli [55, 57], Vibrio vulnificus [87], вырабатывающей энтеротоксины Staphylococcus aureus [91], Clostridiumperfringens и Clostridium botulinum [134].

Первая промышленно выпускаемая аналитическая система для пищевых продук­тов на основе зондов из нуклеиновых кислот была представлена компанией Gene Trak Systems (г. Фрэмингхэм, штат Массачусетс, США) в 1985 году [47]. В ней использова­лись зонды, избирательные для ДНК сальмонеллы и для определения сальмонеллы в обогащенных пищевых пробах, ориентированные на хромосомную ДНК. Процедура анализа включала гибридизацию определяемой ДНК, связанной с мембранным филь­тром, и зондов, меченных фосфором-32. Общее время анализа складывалось из 40-44 ч обогащения пробы в неселективной и селективной средах и последующей процедуры гибридизации, длившейся 4-5 ч. Таким образом, полное время анализа составляло око­ло 2 сут. Проверка теста на Salmonella в США показала, что он, по меньшей мере, эквива­лентен стандартным методам, использующим культуры [49]. Компания Gene Trak созда­ла на основе подобного подхода систему гибридизационного анализа для разновидностей Listeria [73].

Комплекты зондов компании Gene Trak были аттестованы в США, и ряд лаборато­рий начал их использовать. В Европе, однако, в лабораториях пищевых производств наблюдалось нежелание использовать радиоизотопы. Кроме того, фосфор-32 имеет малый период полураспада, что вызывало сложности при транспортировке комплек­тов в отдаленные районы. В 1988 г. компания Gene Trak начала поставлять зонды с неизотопным мечением для Salmonella, Listeria и Escherichia coli и колориметрической системой обнаружения. Для преодоления снижения чувствительности, вызванной использованием неизотопных меток, целевой нуклеиновой кислотой в клетке была рибосомная РНК. Количество копий этой нуклеиновой кислоты на одну клетку оце­нивается в 500-20 ООО.

Колориметрический гибридизационный анализ основан на реакции гибридизации в жидкости между определяемой рРНК и двумя отдельными олигонуклеотидами с помощью ДНК-зондов (иммобилизованного зонда и зонда-сигнализатора), специфи­ческими для определяемого микроорганизма. Молекулы иммобилизованного зонда с помощью ферментов дополнены полимером, состоящим примерно из 100 остатков дезоксиаденозина монофосфата. Молекулы зонда-сигнализатора химически помеча­ют гаптен флуоресцеином.

После соответствующего обогащения исследуемого продукта проба переносится в пробирку, и микроорганизмы разлагаются, выделяя определяемую рРНК. Затем до­бавляют иммобилизованные, и зонды-сигнализаторы проводят гибридизацию. Если определяемая рРНК присутствует в пробе, то происходит гибридизация между зонда­ми и определяемой рРНК. Раствор, содержащий комплекс «зонд-определяемый мик­роорганизм», затем приводят в контакт с датчиком, содержащим связанный гомопо­лимер дезокситимидин (в условиях, при которых возможна гибридизация между полимером полидезоксиаденозином иммобилизованного зонда и полидезокситимидином на датчике). Негибридизованные нуклеиновые кислоты и остатки клеток затем смывают, оставляя иммобилизованный комплекс ДНК-РНК прикрепленным к по­верхности датчика. Связанный зонд-сигнализатор с флюоресцеином определяется пу­тем добавления антифлюоресцеинового антитела, конъюгированного с ферментом пероксидазы. Последующее добавление хромогенного субстрата для фермента приводит к появлению окраски, которая может измеряться спектрофотометром.

Результаты колориметрических анализов [88] показали хорошее совпадение меж­ду зондовыми методами и традиционными, основанными на культурах для Salmonella и Listeria. Оказалось, что чувствительность комплектов лежит между 105 и 106 опреде­ляемых микроорганизмов на 1 мл, в связи с чем важным этапом является процедура обогащения. После внедрения трех указанных комплектов компания Gene Trak начала выпуск систем для Staphylococcus aureus, разновидностей Campylobacter и Yersinia enterocolitica.

Серийно выпускаемые зонды на основе нуклеиновых кислот для подтверждения наличия Campylobacter, Staphylococcus aureus и Listeria поставляются компанией Gen- probe (Gen Probe Inc., г. Сан-Диего, США). Эти комплекты основаны на зонде из однонитевой ДНК, комплементарной рибосомной РНК определяемого микроорганизма. После того как рибосомная РНК выделена из микроорганизма, меченый зонд ДНК соединяется с ней и образует стабильный гибрид комплементарных ДНК и РНК. Гиб­ридизированный зонд может быть обнаружен благодаря люминесценции.

Для анализа также используется метод гибридизационной защиты, основанный на использовании хемилюминесцентного сложного эфира акридина. Этот эфир реагирует с пероксидом водорода в щелочных условиях, испуская свет, который можно измерить в люминометре. Сложные эфиры акридина ковалентно связаны с синтетическими ДНК- зондами через алкиламиновую цепь. Анализ основан на дифференциальном химичес­ком гидролизе эфирной связи. Гидролиз этой связи делает акридин постоянно нехемилюминесцентным. Когда ДНК-зонд, к которому прикреплен эфир, гибридизируется с РНК-мишенью, акридин защищен от гидролиза и может поэтому стать люминесцент­ным. В комплектах для анализа на Campylobacters Listeria используются лиофилизированный реагент-зонд. Зонд Campylobacter реагирует с С. jejuni, С. coli и С. pylori; зонд Listeria реагирует с L. monocytogenes. В обоих случаях перед использованием зонда для подтверждающих испытаний необходимо значительное обогащение культур.

Оценка комплекта зондов для L. monocytogenes [21] показала, что он абсолютно специфичен к организму-мишени. Для получения положительного результата требо­валось присутствие около 106 L. monocytogenes. Данный комплект представляется бы­стрым и надежным тестом для подтверждения присутствия культуры и может исполь­зоваться непосредственно с бульоном для обогащения, тем самым дополнительно снижая продолжительность теста.

Будущее зондов

Разработка и использование зондов в пищевой промышленности в последние годы продвинулись недостаточно. Выпускаемые комплекты демонстрируют свой большой потенциал, но используются не так широко, как иммунологические тесты. Микробио­логи всегда должны учитывать полезность анализа клеточной генетической информа­ции. Возможно, однако, что достижения молекулярной биологии означают, что лучший способ получения подобной информации — это использование методов амплификации нуклеиновых кислот (например, цепной реакция полимеразы — ЦРП).

Методы амплификации нуклеиновых кислот

В последние годы разработаны и усовершенствованы несколько генетических амплификационных методов (методов усиления). Эти методы обычно опираются на биохи­мическую амплификацию клеточной нуклеиновой кислоты и могут привести к увели­чению числа копий за 2-3 ч в 10 7 раз. Очень быстрое увеличение количества мишеней, достигаемое с помощью методов амплификации нуклеиновых кислот, делает их иде­альными для разработки систем ускоренного обнаружения микроорганизмов. В насто­ящее время разработан ряд методов амплификации, примененных для определения микроорганизмов:

• цепная реакция полимеразы (ЦРП) и ее варианты, включая гнездовую ЦРП, ЦРП с обратной транскриптазой (РНК-зависимая ДНК-полимераза) и множе­ственную ЦРП;
• Q-бета репликаза;
• реакция амплификации лигазы (LAR)\
• амплификация транскриптов (TAS), известная также Self Sustained Sequence Replication (3SR) или амплификация на основе последовательности нуклеино­вых кислот (NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification).

Из этих амплификационных методов только ЦРП была внедрена в промышлен­ность в виде методики, основанной на комплекте для определения пищевых микроор­ганизмов. С помощью NASBA проведены различные исследования, имеется ряд работ, описывающих применение этого метода для определения пищевых патогенов, но до сих пор на рынке отсутствуют серийно выпускаемые комплекты для анализа.

Цепная реакция полимеразы (ЦРП)

ЦРП — это метод, применяемый для повторяемого in vitro ферментного синтеза специ­фических последовательностей ДНК с использованием двух коротких олигонуклеотидных праймеров Эти праймеры гибридизируются с противоположными нитями молекулы ДНК и примыкают к представляющей интерес области ДНК-мишени. ЦРП протекает через серию вторичных циклов, включающих денатурацию ДНК, отжиг праймеров и увеличение праймеров под действием полимеразы ДНК. Эти три стадии каждого цикла регулируют, изменяя температуру реакции, так как каждая стадия про­исходит только при определенных температурах. Эти изменения температуры осуще­ствляются с помощью специального прибора для термоциклирования. Продукты уве­личения праймеров после одного цикла служат матрицами для следующего цикла, и, таким образом, количество копий ДНК-мишени удваивается в каждом цикле.

Цепная реакция «обратная транскриптаза-полимераза» (ЦРОТ-П)

Эта реакция включает использование для ЦРП РНК-мишени. ЦРП должна работать на молекуле ДНК, и поэтому первоначально обратная транскриптаза используется для получения копии ДНК, после чего эта копия используется в традиционной ЦРП. Цеп­ная реакция «обратная транскриптаза-полимераза» (ЦРОТ-П) особенно хорошо под­ходит для определенных микробиологических тестов. Некоторые пищевые вирусы содержат в качестве генетического материала РНК. Поэтому, если необходимы ампли­фикация и, соответственно, определение вирусов, необходимо использовать именно ЦРОТ-П. Второе применение ЦРОТ-П — это определение жизнеспособных микроор­ганизмов. Одна из проблем, связанных с ЦРП — ее высокая чувствительность и способ­ность увеличивать очень низкие концентрации определяемой нуклеиновой кислоты. Та­ким образом, при использовании ЦРП для определения наличия или отсутствия определенного микроорганизма в пищевом продукте эта реакция может определить микроорганизм даже в том случае, если он предварительно был сделан неактивным вследствие соответствующего технологического процесса. Это может привести к оши­бочному положительному результату определения. Для преодоления этой проблемы можно использовать ЦРОТ-П, направленную на информационную РНК клетки, кото­рая производится только активными клетками и после образования имеет короткое время полураспада. Таким образом, определение специфической информационной РНК (инфРНК) с помощью ЦРОТ-П указывает на наличие жизнеспособных микро­организмов.

NASBA

NASBA — это многоферментная многократная процедура амплификации, требующая большего числа ферментов и реагентов, чем стандартная ЦРП. Ее преимущество в том, что это изотермическая процедура, и, следовательно, все стадии реакции происходят при одной температуре, что делает ненужным устройство для термоциклирования. Опубликован ряд работ по применению NASBA для определения пищевых патогенов (см., например, [128]), но эта процедура еще не нашла широкого применения.

Промышленные комплекты на основе ЦРП

В настоящее время комплекты на основе ЦРП для определения микроорганизмов в пищевых продуктах выпускаются тремя фирмами. В комплекте ВАХ (фирма Qualicon, США) используются таблетированные реагенты, традиционное устройство для термо­циклирования и метод, основанный на электрофорезе в геле. Пробы с положительной реакцией видны как полосы на геле для электрофореза. Выпускаются комплекты ВАХ для Salmonella [9], Listeria рода Listeria monocytogenes, и для E. coli 0157:Я7. Анализы на Salmonella и E.coli 0157:#7 прошли испытания в Ассоциации научно-исследовательс­кого института химиков-аналитиков (AOACRI) и были им аттестованы.

Вторая серийно выпускаемая группа комплектов для ЦРП — это комплект Probelia (фирма Sanofi, Франция), где используется традиционная ЦРП с последующим имму­нологическим анализом и системой колориметрического определения Salmonella и Listeria.

Последняя выпускаемая система для ЦРП — это система TaqMan (фирма Perkin- Elmer, США). В ней используется новая зондовая система, включающая метку TaqMan Label Она не флюоресцирует в исходном виде, но после того, как зонд связан между праймерами ЦРП, на него может действовать фермент полимераза ДНК, используе­мый в ЦРП для формирования флюоресцирующего конечного продукта. Эта флюорес­ценция определяется с помощью специальной системы обнаружения. Выпускаются ком­плекты TaqMan для Salmonella, разрабатываются комплекты для Listeria и E. coli 0157. Одна из наиболее интересных перспектив применения TaqMan — это количественное определение. В настоящее время все системы на основе ЦРП служат для определения наличия или отсутствия микроорганизмов, а методики и приборы TaqMan могут дать информацию о фактической численности микроорганизмов, то есть ЦРП здесь при­меняется для их быстрого подсчета.

Выделение микроорганизмов из пищевых продуктов и их концентрирование

В последние годы наблюдается значительный интерес к потенциальным возможностям выделения микроорганизмов из пищевых продуктов и последующего концентрирова­ния их для получения более высокого их количества в единице объема. Этот интерес вызывай тем, что многие существующие методы экспресс-тестирования имеют огра­ниченную чувствительность — например, 10 4 /мл для АТФ-люминесценции, 10 6 /мл — для электрических измерений, 10 5 -10 6 /мл — для иммунологического анализа и ДНК- зондов, около 10 3 /мл — для существующих комплектов на основе ЦРП. Эти уровни чувствительности означают, что период роста, требуемый обычно перед экпресс-опре- делением, может значительно увеличить общее время анализа.

Один из способов решения этой проблемы связан с отделением и концентрирова­нием микроорганизмов из пищевых продуктов, чтобы можно было определять микро­организмы в более высокой концентрации. Дополнительное преимущество заключает­ся в том, что клетки микроорганизмов могут быть отделены от пищевой матрицы, которая в некоторых случаях может содержать материалы, мешающие определению. Простой пример использования концентрирования — это анализ чистых жидкостей (воды, прозрачных безалкогольных напитков, вин, пива и т. п.), в которых уровни за­грязнения обычно очень низки. Поэтому для концентрирования микроорганизмов в небольшой зоне большие их объемы подвергают мембранному фильтрованию. Задер­жанные микроорганизмы могут затем быть проанализированы. Подробный анализ ме­тодов концентрирования приведен в работе [11]. Можно выделить пять категорий та­ких методов: фильтрация, центрифугирование, фазовое разделение, электрофорез и иммунные методы.

Из этих категорий стадии промышленного производства для применения в анализе твердых пищевых продуктах достигли лишь иммунные методы. Иммуномагнитное отделение основано на покрытии маленьких магнитных частиц специфическими анти­телами для определенной клетки. Покрытые частицы могут быть добавлены в пище­вую суспензию или питательную среду, и в случае присутствия определяемых клеток они прикрепляются к антителам на этих частицах.

Применение магнитного поля удерживает частицы с прикрепленными к ним клет­ками, позволяя слить избыток жидкости и пиЩевые остатки, и, тем самым, отделить клетки от пищевой матрицы и сконцентрировать их. Такая система выпускается ком­паниями Dynal (Норвегия), LabM (Великобритания) и Denka (Япония), а автомати­зированную систему на основе такой процедуры производит Foss Electric (EIAFOSS). Комплекты для Salmonella, Listeria, Е. coli 0157, других производящих вероцитотоксин Е. coli и Campylobacter производят разные фирмы. Системы, реализующие методы иммуномагнитного разделения для определения присутствия Е. coli 0157, нашли ши­рокое применение, и во многих странах эти методы стали стандартными.

Распознавание и определение характеристик микроорганизмов

После выделения микроорганизмов из пищевого продукта иногда необходимо устано­вить, какой именно это микроорганизм. Это особенно важно, если предполагается, что это патоген. Традиционно в методах идентификации использовались биохимические или иммунологические анализы, а также очищенные микроорганизмы. Прогресс мо­лекулярной биологии сделал возможным идентификацию микроорганизмов по струк­туре их ДНК. Чувствительность методов, основанных на ДНК, фактически делает возможной идентификацию до уровня ниже, чем вид (обычно эту процедуру называ­ют характеризацией или субтипированием). Субтипирование — это новый мощный инструмент, используемый микробиологами не только для обозначения микроорга­низма, но и для установления его происхождения. Поэтому в некоторых случаях можно выделить микроорганизм в готовом продукте, а затем с помощью структури­рованной серии тестов найти, было ли его источником определенное сырье, среда в производственной зоне или плохо вымытые части оборудования.

Разработан ряд основанных на ДНК методов анализа, которые делают возможным субтипирование (многие из них рассмотрены в [17]), однако лишь один метод был полностью автоматизирован и стал доступен для микробиологов лабораторий пище­вых предприятий. Это риботипирование с помощью прибора Qualicon RiboPrinter (фир­мы Qualicon, США). В этот полностью автоматизированный прибор подают выделенные очищенные колонии бактерий и получают образцы диапазонов ДНК (RiboPrint-структуры), которые автоматически сравнивают с базами данных для идентификации и характеризации. Метод успешно применен в пищевой промышленности для определе­ния загрязнений, выявления источников и путей загрязнения, а также проверки аутен­тичности культур [12].

Будущее микробиологических методов

Традиционные микробиологические методы в последние несколько десятилетий не очень существенно изменились. Для подсчета, обнаружения и идентификации микро­организмов в пробах микробиологи в основном продолжают использовать длительное обогащение и методы, основанные на росте микроорганизмов на агаре. По мере разви­тия технологии пищевых производств постоянно растет потребность во все более быс­тром получении микробиологических данных.

Ускоренное развитие рынка охлажденных продуктов и производство продуктов с относительно короткими сроками хранения привели к созданию ускоренных автома­тических методов и систем для их реализации. Их применение делает возможным: а) тестирование сырья перед использованием; б) контроль санитарно-гигиенического состояния технологических линий в реальном времени и в) тестирование готовых продуктов за более короткое время. Все это должно привести к созданию продуктов более высокого качества с увеличенными сроками хранения.

Все рассмотренные в этой главе методы в настоящее время используются в лабора­ториях пищевых производств. Некоторые методы (например, электрические) разра­ботаны, внедрены и используются уже достаточно давно, тогда как другие (например, ЦРП) разработаны гораздо позже. Все эти методы имеют хорошие перспективы, при­няты в качестве стандартных и не являются совершенно новыми. Некоторые произво­дители пищевых продуктов уже начинают понимать преимущества комбинирования различных экспресс-методов для получения еще более быстрых результатов. Приме­ром может служить использование ферментного иммунологического анализа для об­наружения присутствия подвидов Listeria с последующим использованием зондов из нуклеиновых кислот (специфичных для разновидностей микроорганизмов) для под­тверждения присутствия или отсутствия L. monocytogenes.

Одной из проблем некоторых экспресс-методов является их недостаточная чув­ствительность. Во многих случаях это означает, что перед их использованием требует­ся длительное обогащение. Исследования методов отделения и концентрирования микроорганизмов из пищевых проб позволили бы отделить микроорганизмы от пище­вых остатков и сконцентрировать их, исключая необходимость в длительных процеду­рах инкубации. Разработки в области ДНК-методов для обнаружения и идентифика­ции/характеризации ведут к созданию новых средств для микробиологов пищевых производств. Несомненно, что в будущем они дадут такие возможности для анализа, которые сегодня трудно себе представить.

Литература для всего раздела » Традиционные и ускоренные методы микробиологического анализа.»