научная статья по теме КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ АМИНОКИСЛОТ Химия

Текст научной статьи на тему «КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ АМИНОКИСЛОТ»

ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2009, том 64, № 6, с. 655-659

КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ АМИНОКИСЛОТ

* Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

119571 Москва, просп. Вернадского, 86 ** Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 07.04.2008 г., после доработки 28.08.2008 г.

Изучена возможность разделения смесей свободных генетически кодируемых аминокислот методами капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) с УФ- и рефрактометрическим детектированием. Методом КЗЭ достигнуто разделение 16 аминокислот, МЭКХ - 14 аминокислот.

Свободные аминокислоты (АК), входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение. Изменение их концентрации часто связано с метаболическими нарушениями, которые свидетельствуют о развитии того или иного заболевания (сахарный диабет, остеопороз, гипогликемия, нарушения нервной системы и др.). В настоящее время для разделения и идентификации аминокислот используют хроматографические методы - ионообменную [1], обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную [2] и газовую [3] хроматографию. Данные методы требуют достаточно сложного аппаратурного оформления и больших количеств дорогостоящих токсичных реактивов. Большинство существующих методик определения АК включают в себя трудоемкую стадию дериватизации. Полученные производные детектируют фото- или флуориметрически [4]. Следует отметить, что масс-спектрометрический способ детектирования, не требующий предварительной модификации компонентов, отличается высокой себестоимостью и редко применяется для рутинного анализа [5].Существенного упрощения схемы анализа можно ожидать, если использовать капиллярный электрофорез (КЭ) [6].

Целью данной работы является изучение возможности разделения свободных аминокислот методом капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым фотометрическим и рефрактометрическим детектированием.

Реагенты. Для приготовления растворов использовали реактивы квалификации не ниже ч.д.а. Деионизованную воду получали с использованием системы ШШ^ (Франция). Перед анализом все

жидкости фильтровали через мембраны Millipore (Франция) с диаметром пор 0.22 мкм. Фоновым электролитом служили растворы фосфатов и тет-раборатов натрия, их свойства модифицировали добавлением 2-пропанола или метанола. Для МЭКХ в качестве мицеллообразователя использовали доде-цилсульфат натрия (ДДСН). В роли маркера электроосмотического потока применяли 5%-ный водный раствор диметилсульфоксида (ДМСО). Растворы генетически кодируемых аминокислот готовили растворением 1-5 мг в требуемом объеме 0.1 М три-фторуксусной кислоты.

Аппаратура. Капиллярно-электрофоретиче-ский анализ с УФ- детектированием (208 нм) проводили на комплексе капиллярного электрофореза Model 270А Capillary Electrophoresis System (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, США); с рефрактометрическим детектированием - CEZAR (ОАО "Прикладные системы", Минск, Беларусь).

Для разделения анализируемой смеси использовали немодифицированные кварцевые капилляры с внешним полиамидным покрытием, которые предварительно последовательно промывали в течение 5 мин водой, 0.2 М раствором NaOH, а затем в течение 7 мин фоновым электролитом. Для КЗЭ с рефрактометрическим детектированием применяли капилляры длиной 90 см (эффективная длина 75 см) и внутренним диаметром 50 мкм. Определение проводили при напряжении 20 кВ. Пробу вводили элек-трокинетически в течение 7 с. При разделении методом КЗЭ с УФ-детектированием использовали капилляры с внутренним диаметром 75 мкм, длиной 80 см и эффективной длиной 50 см. Разделение аминокислот методом МЭКХ проводили при напряжении 25 кВ в капилляре длиной 61 см (эффективная длина 41 см) и внутренним диаметром 75 мкм. Пробу вводили с помощью вакуума в течение 1.5 с.

Таблица 1. Времена миграции (?мигр), их воспроизводимость и коэффициенты селективности при разделении АК методом КЗЭ с рефрактометрическим детектированием (п = 8, Р = 0.95)

Аминокислота ^мигр мин Г а

Аргинин 5.5 6.5 0.081 0.080 1.18 1.23

Лизин 6.5 8.0 0.082 0.068 1.15 1.31

Пролин 7.5 13.5 0.048 0.026 1.27 1.19

Аланин 9.5 10.5 0.060 0.064 1.05 1.02

Тирозин 10.0 10.7 0.037 0.048 1.50 1.07

Серин 15.0 11.4 0.017 0.052 1.30 1.01

Аспарагиновая кислота 19.5 11.5 0.019 0.019 1.08 1.17

Метионин 21.0 16.0 0.017 0.038 - -

Таблица 2. Времена миграции (£мигр), их воспроизводимость и коэффициенты селективности при разделении АК методом КЗЭ с прямым УФ-детектированием (п = 10, Р = 0.95)

Аминокислота 'ми^ миН ^Г а

Лизин 35.5 0.024 1.07

Аргинин 38 0.018 1.05

Гистидин 40 0.015 1.10

Глицин 44 0.016 1.08

Аланин 47.5 0.025 1.18

Валин 56 0.011 1.04

Изолейцин 58 0.013 1.15

Лейцин 59.4 0.009 1.03

Серин 61 0.008 1.06

Треонин 65 0.013 1.01

Метионин 66 0.010 1.06

Фенилаланин 70 0.008 1.03

Глутаминовая кислота 72 0.009 1.04

Пролин 75 0.012 1.06

Тирозин 79.5 0.009 1.03

Аспарагиновая кислота 82 0.014 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разделение методом КЗЭ с рефрактометрическим детектированием. Лучшее разделение смесей АК наблюдали при использовании фоновых электролитов со значением рН более 7. Это может быть следствием более существенного различия в значениях рКа аминогруппы по сравнению с карбоксильной группой в АК с различными по природе и свойствам радикалами. Фоновый электролит, содержащий 60 мМ боратного буферного раствора (рН 11.0) позволяет идентифицировать аргинин, лизин, про-лин, серин, аспарагиновую кислоту, аланин, тирозин и метионин, т.е. АК, для которых различия времен миграции превышает 1 мин (табл. 1). Аналогичную картину разделения, но с худшим разрешением пиков, наблюдали при использовании 50 мМ фосфатного фонового электролита (рН 11.4). Выполненные исследования показали, что приборное обеспечение для КЗЭ с рефрактометрическим детектированием позволяет разделить и идентифицировать не более 8 АК (рис. 1).

Разделение методом КЗЭ с УФ-детектировани-

ем. Для достижения более эффективного разделения анализируемой смеси к буферным растворам добавляли различные органические модификаторы. При этом использовали фоновые электролиты с рН < 7. Присутствие 30% метанола в 150 мМ фосфатном буфере (рН 2.0) существенно улучшает разрешение пиков и позволяет провести полное разделение смеси 16 свободных генетически кодируемых аминокислот (рис. 2). При этом одновременно возрастают их времена миграции (табл. 2). Увеличение значения рН приводит к заметному ухудшению разделения смеси анализируемых аминокислот.

КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ 657

Рис. 1. Разделение смеси 8 аминокислот методом КЗЭ с использованием рефрактометрического детектирования.

а) Сила тока 93 мкА, 21°С, фоновый электролит: 60 мМ тетраборат натрия (рН 11.0) 1 - аргинин; 2 - лизин; 3 - ЭОП; 4 - пролин; 5 - аланин; 6 - тирозин; 7 - серин; 8 - аспарагиновая к-та; 9 - метионин.

б) Сила тока 82 мкА, 23°С, фоновый электролит: 50 мМ фосфат натрия (рН 11.4)

1 - аргинин; 2 - лизин; 3 - ЭОП; 4 - тирозин + аланин; 5 - серин + аспарагиновая к-та; 6 - пролин; 7 - метионин. Введенные количества АК - 0.1 нг; аланин, тирозин - 0.2 нг.

Разделение методом МЭКХ с прямым УФ-де-тектированием. В качестве мицеллообразователя для фонового электролита использовали додецил-сульфат натрия. Изучено влияние добавок органических растворителей на разделение. Для этого использовали метанол и 2-пропанол. Значения времен миграции исследуемых аминокислот от концентрации добавки приведены в табл. 3. Наилучшие результаты разделения получены при использовании

фонового электролита, содержащего 33 мМ тетра-бората натрия, 100 мМ борной кислоты, 50 мМ ДДСН, 5 об. % 2-пропанола, рН 10.2. На рис. 3 приведена электрофореграмма разделения смеси 14 аминокислот. В табл. 3 представлены значения времен миграции (¿мигр), коэффициентов селективности (а), и воспроизводимость (яг) аминокислот. Из этих данных следует, что продолжительность разделения не превышает 30 мин. времени миграции

30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 X, мин

Рис. 2. Разделение смеси 16 аминокислот методом КЗЭ с прямым УФ-детектированием. Напряжение 10 кВ, сила тока 76 мкА, 28°С, 208 нм, введено 0.5 нг каждого вещества. Фоновый электролит: 150 мМ фосфат натрия, 30 об. % метанол (рН 2.0)

I - лизин; 2 - аргинин; 3 - гистидин; 4 - глицин; 5 - аланин; 6 -валин; 7 - изолейцин; 8 - лейцин; 9 - серин; 10 - треонин;

II - метионин; 12 - фенилаланин; 13 - глутаминовая кислота; 14 - пролин; 15 - тирозин; 16 -аспарагиновая кислота.

Таблица 3. Влияние добавок органических растворителей к фоновому электролиту на времена миграции АК I МЭКХ

Аминокислота с 2- пропанола, % а* с об % ^ метанола' /и

1.0 3.0 5.0 1.0 3.0 5.0

Лизин 5.0 5.5 6.4 0.025 1.06 9.3 12.6 15.6

Пролин 5.1 5.8 6.8 0.028 1.10 9.3 12.6 15.7

Фенилаланин 5.3 6.5 7.5 0.017 1.13 9.4 12.8 16.0

Аланин 6.3 7.6 8.5 0.082 1.09 10.3 13.9 17.3

Валин 7.5 8.2 9.3 0.067 1.10 10.3 14.0 17.6

Глицин 8.3 9.2 10.2 0.034 1.06 10.4 14.2 18.5

Гистидин 8.3 9.3 10.8 0.074 1.15 10.4 14.2 18.5

Тирозин 8.6 11.2 12.4 0.015 1.15 10.4 14.2 18.5

Лейцин 12.2 13.7 14.3 0.033 1.01 10.4 14.2 18.6

Изолейцин 12.2 13.7 14.4 0.022 1.10 10.4 14.2 18.6

Серин 12.9 14.9 15.8 0.017 1.07 14.6 17.2 20.9

Треонин 12.9 15.1 16.9 0.023 1.31 16.8 19.0 22.9

Глутаминовая кислота 18.1 20.5 22.2 0.023 1.26 21.9 26.1 29.8

Цистеин 20.9 25.7 27.9 0.015 - 23.8 28.0 33.1

* Значения и а рассчитаны для фонового электролита, содержащего 5.0 об. % 2-пропанола.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎